174128. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulin tisztítására gélszűréssel
5 174128 6 ként 1,0 mólos ecetsav oldatot alkalmaztak. Figyelemre méltó, hogy Schlichtkrull és munkatársai szükségesnek tartották, hogy a szűrés után a cink-inzulin előállítása céljából még kisózást, izoelektromos kicsapást és cink-kristályosítást is alkalmazzanak. Az inzulin tisztítására a • gélszűrést alkalmazó eddig ismert eljárások mindegyike jelentős inzulinveszteséggel járt. Ezenkívül a technika állásából egyetlen olyan megbízható utalás sem nyerhető, amely szerint a gélszűrés alkalmazásával egyedül inzulint (ideértve a fent már említett inzulinszerű fehérjéket is) lehetne kapni. A találmány szerinti eljárásban általában a fehérje oldatokhoz használható bármely, vízzel duzzasztható gél alkalmazható. Az ilyen gélnek azonban száraz vagy nem duzzadt állapotban a száraz gél súlyára vonatkoztatva legalább kb. 4 súly% vízfelvevőképességgel kell rendelkeznie, szemcséi átmérőinek pedig kisebbeknek kell lenniök kb. 100 mikronnál. A gél vízfelvevőképessége előnyösen a kb. 4% és kb. 98%, a legelőnyösebben pedig a kb. 5% és kb. 20% közötti tartományba esik. A száraz gél részecskék átmérője előnyösen kisebb kb. 80 mikronnál. Különösen előnyösnek találtuk a kb. 20 és kb. 80 mikron közötti szemcseátmérő tartományt. Az alkalmas gélek közé tartoznak például többek között a keményítő (ideértve a kukoricakeményítőt is), a térhálósított galakto-mannán, a térhálósított dextrán, az agar-agar vagy agaróz, a poli-(acil-amid)-ok, az acil-amid és a metilén-bisz(akril-amid) kopolimerjei, a metilén-bisz(akril-amid) vinil-etil-karbitollal és vinil-pirrolidonnal alkotott kopolimerjei és más ezekhez hasonló gélek. Különösen előnyös géleknek találtuk a térhálósított dextránokat, így például a Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N. J., USA cég által gyártott és forgalomba hozott Sephadex-et. Az eljárásban alkalmazott oszlop típusa nem döntő tényező. Az oszlop magasságát, átmérőjét vagy térbeli alakját mindenkor a kívánt üzemi paraméterek, jellemzők függvényében kell megválasztani. Természetesen figyelembe kell venni, hogy az oszlop magasságának növelésével csökken az átáramlás sebessége vagy más szavakkal, az oszlop ellenállása egyenesen arányos az oszlop magasságával. Ezért a Pharmacia Sectional Column KS—370-hez hasonló, szakaszokból álló egyenes oszlop elrendezést találtuk előnyösnek. Szokványos termelési célokra egy 6 szakaszból álló oszlop igen jól megfelel. Jó közelítéssel azt monthatjuk, hogy kielégítő inzulin tisztaság érhető el 4,5 g alkálifém- vagy ammónium-inzulin literenkénti ágytérfogat körüli oszlop terheléseknél, amely terhelést a legelőnyösebbnek találtuk. Az oszlop terhelések azonban általában a kb. 0,8-tól a kb. 6,7 g/liter ágytérfogat értékig terjedhetnek, rmmellett az előnyös tartománynak a kb. 3,5 és a kb. 5,0 g/liter ágytérfogat közötti terhelési tartományt találtuk. A legkedvezőbb viszonyokat természetesen bármely adott oszlop esetében könnyen megállapíthatjuk. A gél duzzasztását és a duzzasztott gél betöltését az oszlopba a szakértő számára jól ismert számos módszer bármelyikével végezhetjük. A gélt általában az eluáló közegben duzzasztjuk. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a gélt 30%-os vizes etil-alkoholban duzzasztjuk, a fmom szemcséket dekantáljuk és a duzzasztó közeget az eluálószerrel cseréljük fel. Az alkálifém- vagy ammónium-inzulint általában desztillált vízben oldjuk és az oldat pH-ját híg bázissal vagy híg szerves kiegyenlítő oldattal 7,5 és 9,5 között a tetszés szerinti kívánt értékekre állítjuk be. Alkalmas bázisok c célra a nátrium-hidroxid, a kálium-hidroxid, a lítium-hidroxid, az ammónium-hidroxid és más, ezekhez hasonló bázisok. Előnyösnek a nátrium-hidroxidot találtuk. Alkalmas szerves pufferek jpéldául a glicin-nátrium-hidroxid a trisz(hidroxi-metil) amino-metán és egyéb hasonló szerves pufferek. Az alkálifém- vagy ammónium-inzulint általában bármely ismert módszerrel előállíthatjuk. Mindamellett előnyösnek találtuk, ha az alkálifém- vagy ammónium-inzulint a 3 719 655 lajstromszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban leírt eljárással állítjuk elő. Amint arra viszont már korábban rámutattunk, az így előállított inzulinnak legalább kb. 80%-os tisztaságúnak kell lennie. Ez más szavakkal annyit jelent, hogy a kapott anyag inzulin tartalmának, ideértve a vércukorszint csökkentő hatású inzulinszerű fehérjéket is, a jelenlevő Összes fehérjék mennyiségének legalább kb. 80%-át kell kitennie. Az oszlopra felvitt inzulin-oldat alkálifém- vagy ammónium-inzulin koncentrációja - amint arra a megelőzőkben már rámutattunk - kb. 1 és kb. 8súly/tf% között van. Előnyösnek a kb, 4 és kb. 6% közötti koncentráció tartományt találtuk. Kielégítő eredmény elérése céljából az alkálifémvagy ammónium-inzulint az alábbiakban tárgyalt elkülönítési térfogatnál kisebb térfogatú oldószerben oldjuk. A kromatográfíában a Kj megoszlási együtthatót mint az oldott anyag koncentrációja a mozgó fázisban és az oldott anyag koncentrációja az álló fázisban hányadosát határozzuk meg. A gélszűrésnél a mozgó fázis a gélrészecskék közötti üres térben mozgó oldószer, míg az álló fázis az az oldószer, amelyet a gélrészecskék magukba szívtak, azaz minden egyes gélrészecske pórusába elkülönült oldószer. A Kd fogalmának felhasználásával, valamely oldott anyag Ve eluálási térfogata a Ve = V0 + Kd • Vj egyenlettel fejezhető ki, ahol V0 az oszlop üres térfogata és Vj a felszívódott oldószer térfogata. Kd-re megoldva, az egyenlet alakot ölt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
