173914. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ismert és új rifamicin-tipusú antibiotikumok előállítására
7 173914 8 Htjuk a micéliumot. E művelethez különféle szűrőtipusok, így például szűrőprések, centrifugák stb. alkalmazhatók. A szilikagélen végrehajtott vékonyréteg kromatográfia hasznos eszköz a M. lacustris által a fermentációs táptalajon termelt antibiotikum-keverék elemzésére és a derített fermentációs léből kinyert nyers és tisztított anyagok összetételének megállapítására. An antibiotikum-keverék összetevőkre történő felbontása lényeges mértékben függ a rendszer antibiotikum terhelésétől, tartalmától. A túlságosan kis antibiotikus aktivitás meghiúsíthatja a kis mennyiségekben jelenlevő antibiotikum összetevők kimutatását, míg a túl nagy antibiotikus aktivitás következménye olyan vonszoló hatás, aminek eredménye gyenge felbontás lehet. A vékonyrétegkromatográfia előhívó rendszere a 4:1:5 arányú etil-acetát-tetrahidrofurán-víz oldószerelegyből álló felső réteg. Az antibiotikum összetevők biodetektoros kimutatását oly módon érhetjük el, hogy a rendszert az antibiotikumra érzékeny Staphylococcus aureus törzzsel vagy más érzékeny mikroorganizmussal beoltott vékony agar-agar réteggel felülrétegezzük. E vékonyréteg kromatogramokat előhívás után szemrevételezéssel is vizsgáljuk. Az antibiotikum-keverékben jelenlevő valamennyi antibiotikum színes, a narancsszín, a sárga és a rózsaszín különböző árnyalatait mutatja. A M. lacustris által termelt rifamicinek az I és II általános képleteknek felelnek meg, amelyekben az R jelentése az egyik esetben a) hidrogénatom (H), a másik esetben b) pedig tiometil-csoport (S-CH3). Az elemi analízis, tömegspektroszkópos vizsgálat és a mágneses magrezonancia spektrum adatai alapján a M. lacustris által termelt antibiotikum-keverék főtömegét, közelítőleg 90%-át, a 3-tiometil-rifamicin S (Ilb) és a 3-tiometil-rifamicin SV (Ib) alkotják. A kisebb mennyiségekben jelenlevő alkotók közül a legnagyobb mennyiségekben, közelítőleg 9%-ban, a rifamicin S (lia) és a rifamicin SV (la) vannak jelen. Kisebb mennyiségű rifamicin S-t és rifamicin SV-t termel a mutáns M. ATCC 21974 törzs. Az új mikroorganizmus a rifamicinek mellett kb. 0,9%-ban egy 32.656-os vegyületnek elnevezett új anszamicint és nyomnyi mennyiségekben, összesen az antibiotikum-keverék mintegy 0,1%-át kitevő mennyiségben egy sor más anszamicint is termel. A rifamicin S és a rifamicin SV között kialakuló oxidációs-redukciós egyensúly e két antibiotikum 3-tiometilszármazékai között is fennáll. A rifamicin SV levegő vagy mangán-dioxid hatására a rifamicin S-sé oxidálható. A rifamicin S viszont aszkorbinsavas kezeléssel könnyen redukálható a rifamicin SV-vé. Hasonló oxidációs-redukciós reakciók hajthatók végre a 3-tiometil-rifacimin S és a 3-tiometil-rifamicin SV eseteiben is. Az antibiotikum-keverék összetevőit egy sor különböző művelettel, így például oldószeres kivonatolással vagy oszlopos kromatográfiával vagy ezek kombinációjával nyerhetjük ki a fermentációs léből. Az antibiotikumok kivonatolására a derített fermentációs léből különböző szerves oldószerek alkalmazhatók. Különösen hatékony oldószernek bizonyult a metil-izobutil-keton. Az oldószeres kivonatolásnál az oldószert előnyösen az antibiotikum-keverék kinyerésére felhasznált fermentációs lé térfogatára vonatkoztatva kb. 1/5 térfogatban alkalmazzuk. A művelethez a feldolgozni kívánt fermentációs lé térfogatától függően különböző berendezéseket, így például választótölcséreket, keverős tartályokat vagy mechanikus extrakciós berendezéseket, így például centrifugális szeparátorokat használhatunk. Az anszamicineket előnyösen redukált állapotban választjuk el és izoláljuk. E célból úgy járhatunk el, hogy a fermentációs lé teljes mennyiségéhez a szűrést megelőzően 2g per gramm antibiotikum-keverék menynyiségben aszkorbinsavat adunk és a rendszert szobahőmérsékleten kb. 30 percig keverjük. Eljárhatunk azonban oly módon is, hogy az antibiotikumokat a kinyerés és bepárlás valamelyik oldószeres fokozatában redukáljuk aszkorbinsawal. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módjánál az antibiotikum-keverék összetevőinek elválasztásánál és kinyerésénél a következőképpen járunk el: A derített fermentációs lé pH-ját 4,0—4,5-re állítjuk be és a fermentációs levet kb. 1/5 térfogat metil-izobutil-ketonnal kivonatoljuk. Az oldószert ezután vákuumban eltávolítjuk, majd technikai tisztaságú etil-alkohollal helyettesítjük. Az etil-alkoholos oldatot most ismételt petroléteres kivonatolással zsírtalanítjuk. Az anszamicineket aszkorbinsavval redukáljuk, az etil-alkoholt vákuumban elpároljuk és a maradékot kloroformmal felvesszük. A kloroformot vákuumban eltávolítjuk és a maradékot szilikagélből készített oszlopon kromatografáljuk, előhívó oldószerként növekvő koncentrációban acetont tartalmazó etil-acetátot alkalmazva. Az elució után vékonyrétegkromatográfiát és biológiai értékmérést hajtunk végre. Az aktív frakciókat a kapott eredményeknek megfelelően egyesítjük A 32.656 jelzésű vegyület a többi anszamicin nyomnyi mennyiségeivel együtt az első frakciókban (0—13% aceton) helyezkedik el. Az aceton koncentrációját az etil-acetát-aceton előhívó elegyben lépcsőzetesen növeljük egészen a kb. 35—50%-ig. A fő oszlopdarabokból eluálás és koncentrálás után kristályos 3-tiometil-rifamicin SV-t kapunk. A 3-tiometil-rifamicin SV-t oxidációval könnyen alakíthatjuk át a 3-tiometil-rifamicin S-sé. Az oxidációt levegővel vagy előnyösen aktivált mangán-dioxidos kezeléssel hajthatjuk végre. Az aktivált mangán-oxidot a J. Org. Chem. 34, No. 6., 1969/1979 lapján ismertetett módon, a mangán-dioxid azeotrópos szárításával állítjuk elő. Az oxidációt ez utóbbi esetben úgy folytatjuk le, hogy az antibiotikum metil-alkoholos vagy etil-acetátos oldatához, az antibiotikum minden grammjára számítva kb. 1 g-nyi mennyiségben hozzáadjuk az aktivált mangán-dioxid iszapját, majd a rendszert szobahőmérsékleten kb. 30 percig keverjük, mialatt az oxidáció lényegében teljessé válik. A reakciókeveréket ezután szűréssel vagy centrifugálással derítjük, az oldószert pedig vákuumban eltávolítjuk. A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikus hatású termékek mindegyike jól alkalmazható számos mikroorganizmus, különösen a Mycobacte-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
