173751. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új rifamicin-származékok előállítására
17 173751 18 A pH-t NaOH-val 7,8-ra állítjuk be és a közeget 50 percig 120°C-on sterilizáljuk. Sterilizálás után a pH 6,4-re csökken. A fermentációt 28 °C-on 200 órán át végezzük. A táptalaj 7,5 pH-ra beállítva feldolgozásra alkalmas. Az 1. és a 2. példa szerint kapott fermentlevet a következő módon dolgozzuk fel: A micéliumot szűréssel elkülönítjük és a szűrletet 10%-os (tf/tf) sósavval 2,0-es pH-ra savanyítjuk, majd egyenlő térfogatú etilacetáttal háromszor extraháljuk. Ezt a szerves kivonatot vákuumban 35 °C-on szárazra betöményítjük és a maradékot (4 g az 1. példából és 11 g a 2. példából) feloldjuk 0,05 mólos 7,5 pH-jú nátriumfoszfát-pufferben és nátriumnitrátot adunk hozzá olyan mennyiségben, hogy a végső koncentráció 0,2% (súly/tf) legyen. A puffer-oldatot 30 percig szobahőmérsékleten keverjük és utána egyenlő térfogatú etilacetáttal háromszor extraháljuk. Az egyesített szerves kivonatokat vákuumban 35 °C-on szárazra betöményítjük. (lásd etilacetátos kivonat). A kimerült pufíer-oldat pH-ját 10%-os sósavval 2,0-re állítjuk és egyenlő térfogatú etilacetáttal háromszor extraháljuk. Az egyesített szerves kivonatokat vákuumban 35 °C-on szárazra pároljuk (2. etilacetátos kivonat). Az 1. etilacetátos kivonatból származó száraz port (1,4 g az 1. példából és 4,2 g a 2. példából) kloroformban oldjuk és szilikagél oszlopon (70-230 Mesh ASTM) kromatografáljuk, eluálószerként 2% (tf/tf) metilalkoholt tartalmazó kloroformot használunk. Az oszlopról eluálható első főtermék, a rifamicin R narancs-barna színéről ismerhető fel. Vékonyrétegkromatográfiásan meghatározva szilikagél-lapok (Merck 60 F2S4) használata esetén (95:5 arányú) kloroform-metilalkohol-oldószer-rendszerrel a rifamicin R 0,59-es Rf értéket mutat. A rifamicin R-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban 35 °C-on szárazra pároljuk, a maradékot etilacetátban újra feloldjuk, amelyet ezután 0. 01 n sósavval mosunk, ezután pedig vizes mosás következik. A szerves kivonatot kis térfogatra 5 betöményítjük, ekkor a rifamicin R 4°C-on kikristályosodik az oldatból (az 1. példából 600 mg-ot, a 2. példából 1,6 g-ot kapunk). A második etilacetátos kivonatot a rifamicin R tisztításához hasonlóan tisztítjuk kromatográfiásan 10 szilikagél oszlopon. A száraz maradékot (2,4 g az 1. példából és 4,2 g a 2. példából) kloroformban oldjuk és a szilikagél-oszlopra visszük. Az oszlopot (98 :2 arányú) kloroform-metilalkohol-eleggyel éluáljuk. Első vegyületként a rifamicin U, utána a 15 rifamicin P és végül a rifamicin Q. különíthető el. Mindhárom vegyület sárgás-narancs színű az eluáló oldatban és a vékonyrétegkromatográfiásan meghatározott helye és mozgása alapján azonosíthatjuk az egyes vegyületeket. Szilikagél lapokon (Merck 20 60 F254) (95:5 arányú) kloroform-metanol-oldószer-rendszert használva a következő Rf értékeket kapjuk: rifamicin U Rf - 0,63 25 rifamicin P Rf = 0,57 rifamicin Q. Rf = 0,32 A rifamicin U, P és G. vegyületeket tartalmazó megfelelő frakciókat egyesítjük és vákuumban 30 szárazra pároljuk, majd a maradékot etilacetátból kikristályosítjuk. Az 1. példa esetén 80 mg rifamicin U vegyületet, 400 mg rifamicin P vegyületet és 280 mg rifamicin Q vegyületet, a 2. példánál pedig 190 mg rifamicin U vegyületet, 900 mg rifamicin P 35 vegyületet és 750 mg rifamicin Q vegyületet kapunk. Lényegében az előző példákban leírt módon járunk el, de termelő törzsekként Nocardia mediterranea ATCC 31065 és Nocardia mediter- 40 ranea ATCC 31036 törzseket használunk és így a fenti vegyületeket állítjuk elő. A fermentációk eredményeit az alábbiakban adjuk meg: Fermentáció Törzs össztermelés mg (nyers termék) ATCC 31065 3700 ATCC 31066 400 Az új rifamicinek fizikai-kémiai jellemzői Rifamicin P 1. Elem-analízis (%): Talált: C = 60,6, H = 6,2, N = 3,8» O =25,2, S = 4,1. 2. U. V. és látható abszorpciós sávok: A vegyület a következő értékeket mutatja: Kitermelés (mg) Rifa P Rifa a Rifa R Rifa V 680 540 1120 135 750 800 1300 90 55 X metanol 0,1 n HC1 max (m n) E}%m ^m«j (m u) E\%cm 60 406 197 416 183 350 (váll) 300 319 297 344 225 521 257 423 65 224 550 9
