173751. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új rifamicin-származékok előállítására
15 173751 16 extraháljuk. Ez a szerves kivonat a rifamicin R elnevezésű új rifamicint tartalmazza. Az extrahált puffer-oldatot 2-4 pH-ig savanyítjuk és utána újból extraháljuk vízzel nem elegyedő oldószenei. Ez a szerves kivonat tartalmazza a rifamicin-család három új tagját, a rifamicin P, Q és U elnevezésű vegyületeket. A rifamicin R további tisztítását kromatográfiásan valamely alkalmas adszorbenst, így szilikagélt, tartalmazó oszlopon végezzük és eluálásra valamely megfelelő szerves oldószerelegyet használunk. A rifamicin P, Q. és U jelű származékokat a rifamicin R vegyületre leírt módszerhez hasonló módon tisztítjuk. A találmányt a következő példákon szemléletesen is bemutatjuk. 1. példa A Nocardia mediterranea ATCC 31064 mutáns törzset 6-8 napot át Bennett-féle agaron szaporítjuk és inkubáljuk 28 °C-on. A ferde tenyészetből kapott kultúrával steril körülmények között két darab 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikot oltunk be, amelyek a következő összetételű vegetatív közeg 100-100 ml-ét tartalmazzák: marhahúskivonat 5 g élesztőkivonat 5 g pepton (Difco) 5 g kazein-hidrolizátum 3 g glükóz 20 g nátrium-klorid 1,5 g víz 1 literre kiegészítve. A pH-t nátrium-hidroxiddal 7,3 értékre állítjuk be. A lombikokat alternatív rázógépre tesszük és így inokuláljuk 28 °C-on 72 órán keresztül. A két Erlenmeyer-lombik tartalmát inokulumként egy 10 literes előfermentorba öntjük, amely 4 litert tartalmaz a fent megadott vegetatív közegből. Az inkubációt 28 °C-on 300 ford./perc keverési sebesség és 1 tf/tf/perc levegőbevezetés mellett hajtjuk végre. 48 órás növekedés után 7—10 súly% sejttömeget kapunk. A következő lépcsőben az alábbi fermentációs közegből 4 litert tartalmazó 10 literes üvegfermentort használunk. földimogyoró liszt 25 g szójabab liszt 5 g diammonium-szulfát 9,5 g magnézium-szulfát-heptahidrát 0,85 g glükóz 95 g glicerin 40 g kálium-dihidrogén-foszfát 1 g propilénglikol 5 g kálcium-karbonát 8,5 g dietilbarbiturát 1,7 g réz-szulfát * pentahidrát 2,8 mg vas(II)-szulfát * heptahidrát 8,5 mg cink-szulfát • heptahidrát 42,5 mg mangán-szulfát • tetrahidrát 3,4 mg kálcium-Morid • szeksztahidrát 1,7 mg (NH*)6Mo7024 * 4H20 0,85 mg víz 1 literre kiegészítve. A pH-t NaOH-val 7,8 értékre állítjuk be és az elegyet 60 percig 120°C-on sterilizáljuk. A sterilizálás után a pH értéke 6,4-re csökken. Inokulumként a fermentor térfogatának 5%-áig terjedő mennyiségű előfermentorból származó anyagot adunk, illetve használunk. A fermentációt 28 °C-on 750 ford./perc sebességű keverés és 1 tf/tf/perc levegőbevezetés mellett végezzük. Habzásgátló anyagként Silicone A néven ismert szert alkalmazunk. A fermentáció folyamán a táptalaj a színét jellegzetes vörösbamára változtatja. Mintegy 200 órás tenyészidő után elegendő mennyiségű sejtet kapunk. A táptalaj pH-ja 7,5 és ebben az állapotban a táptalaj feldolgozásra alkalmas. 2. példa Nocardia mediterranea ATCC 31064 tenyészetet állítunk elő az 1. példában leírt módon, egy lombikban, keverés közben. Ezt az előtenyésztet egy 10 literes üvegfermentorba öntjük, amely 4 litert tartalmaz a következő összetételű közegből: glükóz 5 g földimogyoró liszt 7,5 g kálcium-karbonát 1,65 g magnézium-szulfát • heptahidrát 0,33 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,33 g vas(II)-szulfát • heptahidrát 3,3 mg cink-szulfát • heptahidrát 16,5 mg mangán-szulfát • tetrahidrát 1,3 mg víz 1 literre kiegészítve. A pH-t 7,5-re állítjuk be és a közeget 50 percig 120°C-on sterilizáljuk. Sterilizálás után a pH értéke 6,4-re csökken. 48 órás tenyészidő után a teljes térfogat 6-8%-át kitevő sejttömeg keletkezik. Egy 20 literes üvegfermentorhoz, amely 10 liter következő összetételű fermentációs közeget tartalmaz, 10% inokulumot használunk. kukoricalekvár 20 g szójabab liszt 15 g diammonium-szulfát 6 g magnézium-szulfát • heptahidrát 0,85 g glükóz 100 g káliumdihidrogén-foszfát 1 g kálcium-karbonát 6 g vas(II)-szulfát • heptahidrát 8,5 mg cink-szulfát • heptahidrát 42,5 mg mangán-szulfát • tetrahidrát 3,4 mg réz-szulfát • pentahidrát 2,8 mg kobalt-ldorid • szeksztahidrát 1,7 mg viz 1 literre kiegészítve. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
