173703. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oxitetraciklin előállítására
5 173703 6 A köles oltóspórán jelentkező jelentősebb termelőképesség-visszaesés annak a következménye, hogy a Streptomyces rimosus csak több-generációs növekedéssel — több spórageneráción keresztül — képes a kölesmagvak teljes felületét beborítani. (E.I. Gyemihovszkij, Ju.Sz. Babenko, O.N. Roszkvasz: Ob Antibioticseszkoj aktyivnoszty pokajascsisza szpor bakterij i aktinomicetov. Antibiotiki V. 4. Z. 64-69. Kiev 1969.) A magas termelőképesség visszaállítása érdekében tehát rendszeresen kell új monokultúrákat előállítani mutagén kezeléssel. A mutagén kezelések kimenetele a jelenlegi technikai színvonalon bizonytalan, az irányított mutációk feltételei hiányában csak a nagy számok törvényeinek alávetett, véletlen mutációk eredményeként jelentkezhet a kiindulási monokultúránál magasabb termelőképességű mutáns. Ugyancsak csökkentik a termelőképességet azok a morfológiai változásokkal együttjáró fejlődési fázisok, amelyeket a Streptomyces rimosus mélykultúrás tenyésztésénél figyeltek meg [B. Zamola, G. Tamburasev: Kemija u industriji (Zagreb) 18/9, 593—597, 1969.] e fázisos fejlődés azonban a mélykultúrás tápfolyadék összetételével eredményesebben küszöbölhető ki, mint szelekcióval. (162 728 számú magyar szabadalom) A szakirodalomból ismeretes, hogy a streptomyces törzsek fragmentációja és spóraképzése (a vegetatív fonalak magelemeinek differenciálódása, osztódása, DNS replikációja és a keresztfái-képzés) minden esetben összefügg a mitokondrium sejtfunkcióját betöltő membrán-testek működésével. Streptomycesekben a mitokondrium-analqg membrán-testek a székhelyei az oxidativ foszforizálás enzimeinek és a citokróm-rendszernek. (H.A. Kraszilnyikov: Lucsisztvije gribki 280. Nauka. Moszkva 1970., E. Kellenberger, A. Ryter: J. Biophys. and Biochem. Cytol. 4. 323. 1958., A. Ryter: Bact. Revs. 39-54, 1968.) A szakirodalomból ugyancsak ismeretesek azok a biokémiai és morfológiai változások, amelyeket penészgombákban, élesztőkben, sugárgombákban és baktériumokban akridin festékekkel váltottak ki. [R.M.Acheson (ed): Acridines 723-815, J. Wiley et Sons Inc. 1973., F.E. Hahn and I.Ciak: Elimination of Bacterial Plasmids and Antibiotic Resistance. Ed by V. Krcmery, L. Rosival, T. Watanabe: Avicenum. Prague 1972. J. Subik, M. Behun: Fólia Microbiologica V. 20. (1) 60. 1975., A.M. Boronyin, L.G. Szadovnyikova: Genetika 8/11 174-176. 1972.] Az akridin festékekből mitokondriumok gátlásához sokkal kisebb koncentráció szükséges, mint a sejt egyéb organellumainak gátlásához, (de Vries et Kroon: Febb Letters 7,347-350. 1970., V.M. Borogyina, M.N. Mejszel: Mikrobiologija Tom XLIV. V. 1. 103-107. 1975.) Az irodalmi adatok úgy foglalhatók össze, hogy az akridin vegyületek által kiváltott hatások függjenek azok alkalmazott mennyiségétől, a szervezetek egyedi sajátosságaitól, a tenyésztési körülményektől és a szervezetek fiziológiai állapotától. Az a felismerés, hogy a Streptomyces rimosus spórakonzervek oltóspórává való felszaporítása során, ha a tenyésztés bizonyos lépéseit meghatározott mennyiségű akriflavint (Merck Index IX. 119. sz. vegyület) tartalmazó táptalajokon végezzük, úgy az oltóspóra képes megőrizni a spórakonzerv eredeti termelőképességét, képezi eljárásunk alapját. Eljárásunk tehát alkalmas oxitetraciklin előállítására azzal jellemezve, hogy a Streptomyces rimosus spórakonzervből úgy készítünk üzemi oltóspórát, hogy a felszaporítási-tenyésztési lépéseket 2 — 6xlÓ-3 g/100 ml akriflavint tartalmazó tápfolyadék közbeiktatásával mélykultúrában végezzük, majd ismert módon oltóspórát készítünk, amelyet aerob fermentációs úton oxitetraciklin előállítására alkalmazunk. Eljárásunk kivitelezését az 5. és 6. példákban mutatjuk be. Az 1-6. példákban alkalmazott magas termelőképességű monokultúrát a Streptomyces rimosus OKI-nél 65/1971. letéti számon elhelyezett oxitetraciklin termelő törzs leszármazottai egyikeként izoláltuk. 1. példa Egy magas termelőképességű monokultúrából készített liofilizált spórakonzerv spóráit 0,3 ml Tween-80-at tartalmazó 10 ml desztillált vízben szuszpendáltuk, a kapott spóraszuszpenzió 5 ml-ét 100 ml térfogatú, 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban elkészített R-12 jelű, alábbi összetételű inokulum tápfolyadékba oltottuk: Kazeinhidrolizátum 2,5% Keményítő 2,4% Kukoricalekvár (50%-os) 1,4% Kalcium-karbonát 0,6% Pálmaolaj 2 csepp pH sterilezés előtt: 6,8 A beoltott inokulumot 28°C-on, sík rázóasztalon — melynek kilengési diametere 32 mm volt - 26 órán át rázattuk. Ekkor a tenyészet 50-55%os fragmentációt ért el. Az 50—55%-ban fragmentált tenyészet 5—5 ml-ét 100 ml térfogatú, 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban elkészített R—11 jelű, alábbi összetételű tápfolyadékba oltottuk: Kukoricalekvár (50%-os) 1,6% Keményítő 3,8% (Di)ammónium-szulfát 0,6% Nátrium4dorid 0,5% 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
