173664. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emberi antistaphilococcus immunglobulin előállítására
5 173664 6 közömbösítési módszerét, ahol az alfa toxin Lh értékét pontosan megállapítjuk. A szabványosításhoz használható staphylococcus toxint fiziológiás oldattal Lh/5 értékre hígítjuk. A plazmaforézist önmagában ismert módon hajtjuk végre. Ezen módszer szerint az antistaphylococcus plazmát steril, lezárt rendszerben kettős, lágy PVC zsákokban tartjuk. A plazmaforézist a donorokon havonta 2-4 ml-es adagokban, 7-14 napos időközökkel hajtjuk végre. Ennél az eljárásnál a donoroktól 250 ml immun antistaphylococcus plazmát nyerünk. Az immun plazmát a frakcionálás előtt fagyasztott állapotban, lágy PVC zsákokban (-20)-(—30) °C hőmérsékleten tartjuk. A gammaglobulin frakciónak az antistaphylococcus plazmából történő kivonásához, a plazma frakcionálási etilalkohollal 0 °C alatti hőmérsékleten végezzük. A plazma frakcionálás első lépéseként fibrinogént izolálunk. A második frakcionális lépésben történik meg a globulin kicsapódása. Ebben a lépésben csapódik ki a béta- és gammaglobulin legnagyobb mennyisége. A frakcionálásnál keletkező csapadék, amely a béta- és gammaglobulinon kívül protrombint, profibrinolizint és más proteineket is tartalmaz, felhasználható a további frakcionáláshoz. A plazma frakcionálásának harmadik lépéseként protrombint izolálunk. A második és harmadik frakció csapadékát ugyanolyan térfogatú, 0 °C-ra lehűtött, 2%-os NaCl oldattal szuszpendáljuk. A kapott szuszpenzióhoz 1,5 térfogatrész (a csapadék súlya szerint) 0 °C-ra lehűtött desztillált vizet adunk hozzá. A szuszpenzió pH értéke 5,0-5,1. A kapott keverék térfogatát megmérjük, és a keverékhez keverés közben hozzáadjuk a 0 °C-ra lehűtött acetát-puffert. Az acetát-puffer (11,5 ml kétmólos CH3COOH oldat és 11,5 ml kétmólos CH3COONa oldat) mennyisége 1,5 liter, 1 liter szuszpenzióra számítva. A keveréket 0 °C hőmérsékleten 12 óra hosszat állni hagyjuk. Ezalatt kiválik a protrombin csapadék, amelyet 20 000 fordulat/perc sebességgel történő centrifugálással 0 °C-on kiválasztunk, és az így nyert anyagot felhasználjuk az immunglobulin és a fíbrinolizin előállítására. A plazmafrakcionálás negyedik és ötödik lépésében kiválik az antistaphylococcus immunglobulin. A centrifugálással nyert anyaghoz 0 °C-on ugyanolyan térfogatú, —3 °C-ra lehűtött 26%-os alkoholt adunk hozzá. A keverék pH értékét mólos NaOH oldattal vagy mólos HC1 oldattal 5,0—5,1 álékre állítjuk be. Az alkohol hozzáadásakor a keverék hőmérsékletét 0 °C-ról —4 °C-ra csökkentjük. Ezen feltételek mellett béta-globulin, lipoid, profibrinolzin és egy kevés gammaglobulin válik ki. A csapadékot szupercentrifugával -4°C hőmérsékleten szétválasztjuk, és fíbrinolizin előállítására használjuk fel. A centrifugátumot átlátszó filtrátum nyeréséig -3C° és - 5C° közötti hőmérsékleten papírpéppel szűrjük. Az átlátszó filtrátumban a pH értéket 1 mólos NaHC03 oldattal 6,9—7,0 értékre növeljük. Ezután a -15°-ra lehűtött 96%-os alkoholból 0,16 litert adunk 1 liter oldathoz, és így a keverékben 25% lesz az alkoholkoncentráció. A keverék hőmérséklete —9 °C. Ilyen feltételek mellett immunglobulin csapódik ki, amelyet szupercentrifugában leválasztunk. A tisztított immunglobulin nyers csapadékát lemérjük, steril fiziológiás oldatba visszük 1:1,5 arányban, majd 500 ml-es palackokba 200 ml-t töltünk, (—35)—(—40) °C-on megfagyasztjuk, és liofilizáljuk. A kiszárított immunglobulinból 10%-os oldatot készítünk, ebben feloldjuk a kiszárított port, és apirogén desztillált vízhez adjuk. A víz mennyisége egyenlő a nyers csapadékhoz a szárítás előtt hozzáadott fiziológiás oldat mennyiségével. 100 gramm száraz porhoz 0,9 gramm NaCl-t adunk hozzá. Az így kapott oldat protein-tartalmát refraktométerrel meghatározzuk, és szükség esetén az oldatot 10 + 1 súly%-ra állítjuk be, fiziológiás oldattal. A kapott oldatot papírpéppel, majd a boxokban sterilizáló kerámiagyertyákkal vákuumban szűrjük. A steril oldatot 3 ml-es ampullákba töltjük, és az ampullákat leforrasztjuk. 1 liter plazmából 8—10 dózis antistaphylococcus immunglobulin nyerhető. A készítményben a papírelektroforézis után meghatározzuk a protein %-os tartalmát, a sterilizálást, pirogenitást, toxintartalmat és a frakció tisztaságát. Az antistaphylococcus immunglobulin átlátszó, vagy kissé opálos, színtelen, vagy enyhén sárgás oldat. Az antistaphylococcus immunglobulinnak specifikusnak, sterilnek, káros hatásoktól mentesnek és apirogénnek kell lennie. 1 ml készítmény legalább 50 IE staphylococcus alfa antitoxin antitestet tartalmaz, a staphylococcus alfa toxinnak nyulak vörösvér sejtjeivel végrehajtott haemolitikus hatású neutralizális reakciója szerint. Az antistaphylococcus immunglobulin oldat protein tartalma 10 ± 1%. Az elektroferézissel meghatározott gammaglobulin frakcióban legalább 97% protein van. A találmányt a továbbiakban az emberi antistaphylococcus immunglobulin előállítására szolgáló eljárás egy példája alapján ismertetjük részletesebben. Példa Az antistaphylococcus immunglobulin előállításához 20 és 40 év közötti önkéntes donorokat választunk ki. A donorokat a véradás és a plazmaferézis szempontjai szerint orvosi vizsgálatnak vetjük alá. Ezután a donorokat abszorbeált staphylococcus anatoxinnal immunizáljuk. Az egyçs injekciókat 1,0, 1,0 és 2,0 ml-es adagokban 7 na />s időközökben adjuk be. Amikor a donorok vérében a staphylococcus alfa antitoxin legalább 5 IE/ml mennyiséget ér el, a staphylococcus alfa toxin neutralizálási reakciójában, a donorokon végrehajtjuk a plazmaforézist a szükséges mennyiségű hiperimmun antistaphylococcus plazma összegyűj-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
