173662. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ovulációt serkentő új nonapeptidamid-származékok előállítására
13 173662 14 Ser = 0,97, Tyr = 0,97, Ala = 1,00, Leu =1,04, Arg = 1,03, Pro = 1,00, etil-amin = 1,02 (86%-os átlagos visszanyerés). Hasonló módon a (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NHCH3 képletű polipeptid-amid állítható elő, ha a fenti (b) lépésben Z-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 helyett kiindulási anyagként Z-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH3 képletű anyagot használjuk. Ennek a terméknek fizikai és kémiai jellemzői az alábbiak: Fajlagos forgatóképesség [a]ßÄ= —48,1° (c = 0,6, 5%-os ecetsavban). Rf‘= 0,055, Rf2= 0,335. Aminosav-elemzés (hidrolízis sósavval tioglikolsav jelenlétében): Glu = 1,00, His = 1,02, Trp = 0,89, Ser = 090, Tyr = 098, Alá = 1,00, Leu = 1,00, Arg = 1,04, Pro = 1,02, metil-amin = 097 (849%-os átlagos visszanyerés). 2. példa (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2 -CH2 -CH3 előállítása (a) Z{D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH2-CH3 előállítása Hidrogén-bromid jégecettel készült 25%-os oldatából 2 ml-ben feloldunk 720 mg Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2 -CH2 -CH3 -t, majd az oldatot 40 percen át rázzuk és ezt követően 20 ml vízmentes étert adunk hozzá. A képződő csapadékot kiszűrjük, majd vízmentes éterrel mossuk. Az így kapott port ezt követően csökkentett nyomáson exszikkátorban nátrium-hidroxid felett szárítjuk. A szárított port 5 ml dimetil-formamidban feloldjuk, majd 230 mg Z-(D)-Ala-OH és 200 mg HONB adagolása után az oldatot jéggel lehűtjük és trietil-amin dimetil-formamiddal készült 10%-os oldatából 1,5 ml-t adunk hozzá. A kapott oldathoz ezután még 230 mg DCC-t adunk, majd az elegyet szobahőmérsékleten 10 órán át keverjük. Ezt követően csökkentett nyomáson a dimetil-formamid túlnyomó részét ledesztilláljuk, majd a maradékot 50 ml etil-acetátban feloldjuk. Az oldatot ezután szűrjük az oldhatatlan rész elkülönítésére, a kapott szűrletet pedig először 3-szor 4%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 2-szer vízzel mossuk. Az oldatot ezután vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk és az etil-acetátot ledesztilláljuk. A maradékhoz étert adunk, majd a kicsapódott port kiszűrjük. A port ezután melegítés közben etil-acetátban feloldjuk, majd éterrel végzett újrakicsapás útján tisztítjuk. A fentiekben ismertetett módon a por alakú cím szerinti vegyületből 723 mg-ot kapunk. Fajlagos forgatóképesség [a]^5- -48,0° (c=l,0, metanolban). Elemzési eredmények a C3iH4808N9 képlet alapján: számított: C =55,18%, N = 18,68%, H =7,17%, talált: C =54,89%, N =18,44%. H =7,32%, Rf4 = 0,62. (b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2 -CH2 -CH3 előállítása 10 ml ecetsav és 10 ml metanol el egyében feloldunk a fenti (a) lépésben kapott Z-(D)-Ala-Leu-Arg(N02 )-Pro-NH-CH2-CH2-CH3-ból 150 mg-ot, majd a kapott elegyen 50 mg szénhordozóra felvitt palládium katalizátor jelenlétében 4 órán át hidrogéngázt vezetünk át. A katalizátort ezután kiszűrjük, majd a szűrletből csökkentett nyomáson az oldószert ledesztilláljuk. A kapott maradékot ezt követően 0,4 ml In sósavoldat és 10 ml víz elegyében feloldjuk, majd az oldatot liofilizáljuk. így fehér pelyhes port kapunk. Ezt a terméket és 141 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH-t feloldunk 10 ml dimetil-formamidban, majd a kapott oldathoz 60 mg HONB-t és N-etil-morfolin dimetil-formamiddal készült 10%-os oldatából 0,25 ml-t adunk. A reakcióelegyet ezután —2 °C-ra lehűtjük, majd 55 mg DCC-t adunk hozzá. Az elegyet ezután jeges hűtés közben 5 órán át, majd szobahőmérsékleten 12 órán át keverjük. A reakció befejeződése után a dimetil-formamidot csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, majd a maradékot 20 ml vízben feloldjuk. A kismennyiségű oldhatatlan anyagot (didklohexil-karbamid) kiszűrjük, majd a szűrletet 1 cm átmérőjű és 4 cm hosszú, Amberlite IRA-410 (acetát formájú) gyantával töltött oszlopra felvisszük, az oszlopot pedig vízzel mossuk. Az eluátumot és a mosófolyadékot egyesítjük, majd 1,5 cm átmérőjű és 25 cm hosszú, karboximetil-cellulózból készült oszlopra felvisszük. 0,005 mólos ammónium-acátát pufferrel végzett mosás után folyamatosan eluálunk 300 ml 0,005 mólos ammónium-acetát pufferrel (pH = 6,8) és 300 ml 09 mólos ammónium-acetát pufferrel (pH = 69). A 160 ml és 230 ml közötti frakciókat összeöntjük, liofilizáljuk, a fentiekkel egyező körülmények között, ismételten kromatografáljuk és másodszor is liofilizáljuk. A terméket ezután 3 cm átmérőjű és 50 cm magas, Biogel P-2 gyantából készült oszlopra felvisszük, majd 5%-os vizes ecetsavoldattal eluálunk és a cím szerinti vegyületet tartalmazó eluátumot liofilizáljuk. így 201 mg fehér pelyhes port kapunk. Fajlagos forgatóképesség: [a]pS=-46,8° (c = 0,5, 5%-os vizes ecetsavoldatban). Rf2= 0,37, Rf‘ = 0,08. Aminosav-elemzés (hidrolízis 5,7 normál sósavoldattal tioglikolsav jelenlétében): His = 097, Arg = 097, Trp = 091, Ser = 091, Glu = l,00, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
