173421. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus úton lipofilizált triglicerid-zsírt tartalmazó táplálék komponens előállítására
173421 4 Mindeddig a következő, forgalomban levő, jellemző eszterázokat és lipázokat használták: pregasztrikus eszterázok, mint például a Dairyland Food Laboratory Italase és Capalase márkanevű termékei, pankreáz lipáz, amelyet Fermlipase PL márkanéven a Fermoo Laboratories forgalmaz, továbbá a Rohm és Haas által előállított és Lipase B néven forgalmazott gomba-lipáz. Az állati eredetű lipolitikus enzimek hiánya miatt a mikrobiológiai forrásokból nyert lipolitikus enzimek azzal a potenciális előnnyel bírnak, hogy nagy mennyiségben állíthatók elő, és ezenkívül fennáll annak a valószínűsége is, hogy a mikroorganizmus szabályozott fermentációja során egységesebb minőségű termék állítható elő. Ugyanakkor nem minden mikroorganizmus lipolitikus enzimei biztosítanak előnyös ízesítő hatást. Úgy találtuk, hogy a Mucor miehei mikroorganizmusból meglepő módon kitűnő minőségű, triglicerid-zsírokat ízesítő, enzimesen termelt készítmény állítható elő. Ezt az enzimes ízesítő készítményt az eszteráz aktivitás (EA) és a lipáz aktivitás (LA) arányával (EA/LA) jellemezzük. Az enzim eszteráz-aktivitás az az aktivitás, amellyel vízben oldódó, nevezetesen 4—10 szénatomos zsírokra hat. Az enzim lipáz-aktivitásán azt az aktivitást értjük, amely vízben nem oldódó, nevezetesen 12 vagy több, elsősorban 12—22 szénatomos zsírok hasadását eredményezi. Ahogy azt a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük, úgy találtuk, hogy bizonyos, a Mucor nemhez tartozó Mucor mieheitörzsek meglepő módon, más gombákkal, például az Aspergillus-szal és Rhizopus-szal ellentétben olyan lipolitikus enzim-komplexet termelnek, amelyek az általánosan használt, borjúból, kecskegödölyéből és bárányból nyert pregasztrikus eszterázokhoz hasonlóan azzal az előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, hogy eszteráz-aktivitásuk nagyobb mint lipáz-aktivitásuk. Ez azt jelenti, hogy az EA/LA hányados egynél nagyobb szám. Az Aspergillus és Rhizopus által termelt lipolitikus enzim-komplex EA/LA hányadosa egynél kisebb szám, így a jelen szabadalmi leírásban kitűzött céloknak nem felel meg. Az EA/LA hányados előnyösen kettőnél nagyobb szám, de különösen előnyös az a készítmény, amelynek az EA/LA arányt megadó mutatószáma 2 és 10 közé esik. Az eszteráz-aktivitást előnyösen tributirin, míg a lipáz-aktivitást előnyösen olívaolaj szubsztráttal határozzuk meg. Ezeket a méréseket a következőképpen végezzük. Az észt er áz-mód szer A módszert tributirint hidrolizáló eszteráz meghatározására használjuk. Az eszterázt 6 pH-jú és 37 C° hőmérsékletű tributirint tartalmazó oldatban inkubáljuk. A reakcióelegyben 10 perc alatt felszabaduló savat pH 8,7-ig titráljuk. Az ajánlott arányok mellett a reakció és az enzim-koncentráció gyakorlatilag lineárisan függ össze. 3 Oldatok 1. Szubsztrát-oldat 114 ml 0,05 mólos nátriumacetát oldathoz (6,8 g NaC2H302 x 3H20 1 literben) 13 g gumiarábikumot (USP) adunk, majd 50 mg timollal egészítjük ki az elegyet, és az oldódás elősegítésére 25 percen át keverjük. 22,7 g (75 mM) tributirint adunk a pufferezett gumiarábikum oldathoz, és Waring-keverőben 5 percen át emulgeáljuk. 0,5 n nátriumhidroxid oldattal 6,0-ra állítjuk be az emulzió pH-ját. 1 ml-nél kevesebb lúg fogy. Az oldatot, ha hűtőben tároljuk, legalább 3 napon át használhatjuk. Használat előtt minden esetben összerázzuk az oldatot, és szükség esetén 6,0-ra állítjuk be a pH-ját. A „vak” minta (lásd alább a „kontrollokat”) készítésére 114 ml 0,05 mólos nátriumacetátban 13 g gumiarábikumot oldunk. Az oldat pH-ját 3—4 ml 0,1 n nátriumhidroxid oldattal 6,0-ra állítjuk be. 2. 0,02 n nátriumhidroxid oldat. 3. 0,05 mólos, 5,9-6,2 pH-jú acetát-puffer. Körülbelül 500 ml vízben 6,8 g, három kristályvizet tartalmazó nátriumacetátot oldunk, 1,0 ml 1 n hidrogénklorid oldatot adunk az oldathoz, majd desztillált vízzel egy literre egészítjük ki. 4. Enzimoldatok Mindegyik oldatot és hígítási sort a 3. számú acetát-pufferral készítünk el. A szükséges koncentrációértékeket a továbbiakban adjuk meg. Eljárás összerázzuk a szubsztrát-oldatot és 50 ml-t 125 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikba pipettázunk. 10,0 ml enzim-oldatot adunk a szubsztrát-oldathoz, azonnal összekeverjük őket, és 10,0 ml alikvótot 40 ml vízben oldunk, aminek a pH-ját 0,02 n nátriumhidroxid-oldattal azonnal 8,7-re állítjuk be. Az alikvót kivételét követően azonnal 37 C° hőmérsékletű fürdőbe helyezzük a visszamaradó elegyet (ezt az időpontot számítjuk 0 percnek), és mágneses keverővei folyamatosan keverjük 40 percen át. Pontosan 40 perc múlva további 10,0 ml alikvótot pipettázunk 40 ml vízhez, majd 8,7-re állítjuk be az elegy pH-ját, közben mérjük a fogyott nátriumhidroxidot. A két titrálás között tapasztalt különbség jelzi az enzim által hidrolizált tributirin mennyiségét. Kontrollok Szubsztrát-vakot nem kell használnunk, de a nyers enzim-készítmények mérésekor enzim-vakot állítunk be kontrollként. A fentiek szerint járunk el, de a beállított gumiarábikumos oldatot tributirin nélkül használjuk, mégpedig a szabályos szubsztrát oldat helyett. Az átlageredményt a kontroll titrálásakor kapott lúgfogyás-különbségekkel helyesbítjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
