173421. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus úton lipofilizált triglicerid-zsírt tartalmazó táplálék komponens előállítására
5 173421 6 Egységek Egy egységnyi eszteráz a fenti mérési körülmények között percenként egy mikroekvivalens mennyiségű savat tesz szabaddá. A készítmény grammonkénti egységszámát az eszteráz-aktivitásban (EA) adjuk meg. Számítás ml NaOH x nNaOH x 1000 x ml kezelt elegy EA =--------------------------------------------- (1) perc x g készítmény a kezelt elegyben x ml alikvót amely képletben a NaOH ml-einek száma a 10 ml térfogatú alikvót minták titrálásakor kapott fogyáskülönbséget, és a nNaOH pedig a titráláskor használt nátriumhidroxid oldat normalitását jelenti. így ml NaOH x 0,02 x 1000 x 60 EA = -----------------------------(2) 40 x g készítmény x 10 ml NaOH x 3 EA = --------------------------------------------------(3) g készítmény a kezelt elegyben Koncentrációértékek A mintákat úgy hígítjuk, hogy a titrálások közötti lúgfogyás-különbség 0,5 ml és 1,5 ml között legyen. Hogy ezeket az értékeket kapjuk, szükség esetén ismételnünk kell a méréseket. A tributirin hidrolízisének mértéke lineáris az idővel, így a 40 perces emésztési szakaszt rövidíthetjük. Ebben az esetben természetesen módosítanunk kell a megfelelő időtényezővel a (3) egyenletet. Lipáz-meghat ározás A módszert az olívaolajat hidrolizáló lipáz meghatározására használjuk. A lipázt 6,5 pH-n és 30 C9 hőmérsékleten olívaolaj-emulzióval inkubáljuk. A reakcióelegyben 5 perc alatt felszabaduló savat pH 8,0-ig végzett titrálással határozzuk meg. A megadott értékeken belül a reakció és az enzim-koncentráció között gyakorlatilag lineáris összefüggés van. Reagensek 1. Olívaolaj, U.S.P. 2. Amerchol L-101 (lanolinból származó szabad szterinek), American Cholesterol Products, Edison, NJ. 3. Nátrium-barbiturát, N.F. 4. Gumiarábikum, U.S.P. 5. Nátriumacetát (3H20), C.P. 6. Nátriumklorid, C.P. 7. 0,5 n NaOH 8. 0,02 n NaOH 9. 0,1 n HC1 10. Etilalkohol (denaturált, No. 23A). Eszközök 1. Waring-keverő. 2. Két mágneses keverő, ezek közül az egyik vízfürdőbe süllyeszthető (MS-7 model, Tri-R Instruments, Jamaica, New York). 3. pH-mérő a titráláshoz, a műszer kisméretű kombinált elektróddal van felszerelve (például No. 4858—L15, Thomas). 4. 10 ml-es, 0,02 ml-es beosztású mikrobüretta (Kimble 17107F, Luer-típusú 20G, 1-1/2” v^gel). Oldatok 1. Szubsztrát-emulzió 270 ml desztillált vízhez 30 g gumiarábikumot adunk, majd 30 percen át, szobahőmérsékleten, mágneses keverővei keverjük az emulziót. A jelen levő darabokat üvegbottal szétkenjük. 5 C* hőmérsékletre hűtjük a készítményt. 6 g Amercholt, 72 g olívaolajat és 222 g lehűtött gumiarábikum oldatot keverünk össze, majd Waring-keverőben 5 percen át keverjük az elegyet. 0,5 n nátriumhidroxid oldattal 6,3-ra állítjuk be a pH-ját, 5 C° hőmérsékletre hűtjük, és további 7 percen át keverjük az elegyet. Az elegy hőmérséklete legfeljebb 47 C°-ra, pH-ja pedig 6,5-re emelkedhet. Az emulzió legalább 8 napon át stabil, ha hűtőben tároljuk. A hűtő hőmérséklete 1 C° alá nem süllyedhet. 2. Pufferek a) Törzsoldat Desztillált vízben 9,7 g nátriumacetátot (3H20) és 14,7 g nátriumbarbiturátot oldunk, majd desztillált vízzel 500 ml-re egészítjük ki az oldat térfogatát. Az oldat a barbiturátra és az acetátra számítva is 0,14, normál, pH-ja 9,9. Hűtőben tároljuk. b) Munkaoldat 40 ml törzsoldatot, 16 ml 8,5%-os nátriumklorid oldatot és 53 ml 0,1 n hidrogénklorid oldatot elegyítünk, majd desztillált vízzel 200 ml-re hígítjuk az elegyet, pH-ja 6,5. A pH beállításához kevés 0,1 n hidrogénklorid vagy nátriumklorid oldatot használunk. Az elegyet hűtőben tároljuk, és kiöntjük, ha a tárolás alatt kristályok válnak ki belőle. 3. Enzimoldatok A szilárd készítmények mérésére először törzsoldatot készítünk oly módon, hogy megfelelő mennyiségű vízzel, mágneses keverő segítségével keverjük a mintát, majd a törzsoldatot vízzel tovább hígítjuk. A törzsoldat 5 C* hőmérsékleten több órán át állandó, de a nagyon híg oldatot 5 percen belül fel kell használnunk. Ismeretlen minták mérésére, hogy eltaláljuk a megfelelő hígítást, három hígítást készítünk. A közelítőleg 5 10 15 10 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
