173410. lajstromszámú szabadalom • Javított baktériumtáptalajt és timidin-foszforilázt tartalmazó kompozició, baktériumok folsav-antagonistákkal szemben mutatott érsékenységének kimutatására, továbbá eljárás a kombozició és az enzim előállítására
5 173410 6 az ECTEOLA-cellulózra történő abszorpció előtt vizes dialízist vagy megfelelő pufferes dialízist hajtunk végre. A találmány szerinti eljáráshoz különösen előnyös az Escherichia coli B-96 (ATCC 13473) alkalmazása. A Salmonella typhimurium LT-2 (ATCC 15277) másik példa egy olyan törzsre, amelyik nagy mennyiségű timidin-foszforilázt termel, és így hasznos a találmány szerinti eljárás szempontjából. Bizonyos esetekben, amikor nagyobb hőstabilitású enzimet kívánunk előállítani, a hatásos enzimet a Bacillus stearothermophilus törzsből izoláljuk. Az Escherichia coli B-96 (ATCC 13473) törzset olyan táptalajban tenyészthetjük, amely minimális sót, valamint a szokásos szén-forrásokat és purinokat élesztő-kivonat-táptalajban tenyészthetjük. Az enzim nyers extraktumát ezután a foszfát-pufferben levő baktérium-sejt ékből készítjük ultrahangos besugárzással, majd centrifugálunk, az elroncsolt sejtek eltávolítása céljából. A nyers extraktumot ezután például kis mennyiségű kalcium-foszfát-géllel keverjük el, majd centrifugáljuk, a nem-kívánatos protein eltávolítására. Az így kapott felső fázist (felülúszó részt) ezután elkeverhetjük a kalcium-foszfát-gél egy további részletével, amelyre az enzim adszorbeálódik. Az aktív enzim többszöri foszfát-pufferes mosással eluálható a gélről. Az enzimet ezután DEAE-cellulózra adszorbeáltathatjuk, majd mosással eluálhatjuk. Dialízis után a készítményt ECTEOLA-cellulózra adszorbeáltathatjuk és onnan eluálhatjuk. Az enzim-aktivitás meghatározása céljából a tisztítás minden lépésénél spektrofotometriás meghatározást végezhetünk, meghatározott hullámhosszon. Az ily módon tisztított enzimből azután előnyösen vizes ammónium-szulfátos szuszpenziót készítünk, és ezt a szuszpenziót alkalmazzuk. Az enzim számos állat szövetében is jelen van, és abból izolálható és tisztítható, de az emlős-szövetekben sokkal kevesebb enzim van, mint a baktériumokban, továbbá a tisztított, mikrobás eredetű timidin-foszforiláz sokszorta aktívabb, mint a tisztított emlős-szövetekből előállított enzim. Azt találtuk, hogy a ló-vér mintegy 40-100 egységnyi timidin-foszforiláz aktivitását (definícióját lásd később) tartalmaz ml-enként. Az 1. példa szerinti Escherichia coli szonikátum e koncentrációinak több mint ezerszeresét tartalmazza. így tehát a tisztított, baktérium-eredetű enzim gazdaságos előállításának számos és jelentős előnye van. Nem csak arról van szó, hogy ez könnyen hozzáférhető és olcsó enzim-forrás, hanem maga az extrakciós és tisztítási eljárás is sokkal gazdaságosabb. A tápközegben a timidin-foszforiláz koncentrációja előnyösen mintegy 2-200 egységnyi enzim-aktivitás/ml közeg, még előnyösebben 5-100 egység/ml, és célszerűen 7-50 egység/ml. A tisztított enzim egy egységnyi enzim-aktivitása az az enzim-mennyiség, amely egy nanomól timin/perc képzését katalizálja a timidin 1 millimólos oldatából, 25 C*on, 200 millimól kálium-foszfát-puffer jelenlétében, pH = 7,4-nél. A táptalajokat, amelyekhez a tisztított timidinfoszforilázt adtuk, alkalmazhatjuk számos organizmus fólsav-ellenes szerekkel szembeni érzékenységi próbájához. Ilyen organizmusok például a Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Vibrio comma, Erysipelothrix rhusiopathiae, Serratia marcescens, iQebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Salmonella Typhosa, Escherichia coli, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus rettgeri, Pseudomonas aeruginosa. A Streptomyces faecalis egy különös kivétel, mert ezzel az organizmussal a timin épp oly hatásos, mint a timidin, nevezetesen valósággal megfordítja a fólsav-reduktáz, például trimetoprim gátlási aktivitását. A tiszított enzimet az előállítási eljárás bármely alkalmas fázisában hozzáadhatjuk a kívánt táptalajhoz. Például aszeptikus módon, steril oldatként adagolhatjuk a közeghez az autoklávból történő kivétel után, amikor a hőmérséklet mintegy 50-55 C*-ra csökken. Az enzim adagolása után a közeget a lehető leggyakrabban tovább kell feldolgoznunk, nehogy az enzimet tartalmazó közeg 5-10 percnél tovább maradjon 50-55 C°-on, és így minimumra csökkenthetjük az enzim inaktiválódását. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás baktériumok fólsav-ellenes szerekkel szemben érzékenység kimutatására szolgáló kompozíció előállítására, oly módon, hogy a tisztított baktérium■eredetű timidin-foszforiláz-készítményt összekeverjük a baktériumtáptalajjal. Az így előállított kompozíciónak az az egyik fő előnye, hogy világos színű és átlátszó, ami megkönnyíti a baktérium-növekedés pontos mérését, a végpont meghatározását a baktériumok fólsav-ellenes szerekkel szembeni érzékenységének meghatározásakor. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi a stabilizált timidin-foszforiláz-készítmény előállítási eljárása, amely készítmény ammónium-szulfátot tartalmaz. A megnövekedett stabilitású készítmény lehet az enzimek ammónium-szulfát-oldatos szuszpenziója. M. Schwartz, Eur. J. Biochem. 21, 191—198 (1971) cikkből ismert, hogy a baktérium-eredetű timidin-foszforiláz —20 C°-on stabil, de 4 C°-on az aktivitása tetemes sebességgel csökken. Azt találtuk, hogy a tisztított enzimkészítmények bomlással szembeni stabilitását nagymértékben fokozhatjuk, ha a készítményhez ammónium-szulfátot adunk, feltéve, hogy a készítmény protein-tartalma legalább 5 ml protein/ml. A protein-tartalomnak nem kell okvetlenül csak az enzimből állnia. Az enzimnek koncentrált (5 mg protein/ml vagy ennél több) foszfát-pufferes oldatait, amelyek 10% ammónium-szulfátot tartalmaznak, például igen hosszú ideig tárolhatjuk, csekély, vagy semmiféle aktivitás-csökkenéssel. Készíthetünk stabil timidin-foszforiláz-szuszpenziókat is vizes ammónium-szulfát-oldatokban. Az alábbi példák a találmány illusztrálására szolgálnak, minden korlátozó jelleg nélkül. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
