173410. lajstromszámú szabadalom • Javított baktériumtáptalajt és timidin-foszforilázt tartalmazó kompozició, baktériumok folsav-antagonistákkal szemben mutatott érsékenységének kimutatására, továbbá eljárás a kombozició és az enzim előállítására
/ 8 Timidin-foszforiláz előállítása és tisztítása Escherichia coli B—96-ot (ATCC 13473) levegőztetett 11 literes edényben 34 C*-on tenyésztünk minimális sókat tartalmazó táptalajban, amely 18,9 g/liter dinátrium-hidrogén-foszfátot, 6,4 g/liter kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,2 g/liter magnézium•szulfát-heptahidrátot, 2,0 g/liter ammónium-szulfátot, 03 g/liter adenozint és 8,0 g/liter kazaminosavakat (Merck Index IX., 18731 Casamino Acids) tartalmaz. A sejteket centrifugálással választjuk el, amikor a tenyészet optikai sűrűsége 600 nm-nél (hígítás nélkül) eléri a 2,0-t. A következő műveleteket 3 C°-on hajtjuk végre, hacsak másképpen nem jelezzük. A 25 g-nyi sejt-pépet 50 g 5 millimólos kálium-foszfát-pufferben (pH = 8,0) [A) puffer] szuszpendáljuk. A sejt-szuszpenziót 5 ml-es részletekben, egyenként 12 percig ultrahanggal besugározzuk, 50 perces hűtési intervallummal. A Branson Model 5125 Sonic Oscillator-t használjuk, 60s műszer állításban. A besugárzott frakciókat összegyűjtjük és 20 percig centrifugáljuk 48 000 g gyorsuláson. A felülúszó réteghez (lásd az 1. táblázat 1. lépését) lassan hozzáadunk 25 ml kalcium-foszfát-gél-szuszpenziót (31 mg száraz szilárd anyag/ml), és 3 C°-on 5 hónapig állni hagyjuk. A keletkező szuszpenziót 10 percig keverjük, majd 5 percig 12 000 g gyorsuláson centrifugáljuk. A felülúszó réteget elkeverjük további 100 ml kalcium-foszfát-gél-szuszpenzióval, és a reakcióelegyet 10 percig keverjük, majd 15 percig 9 700 g gyorsuláson centrifugáljuk. A kapott gél-gömböcskéket 100 ml A) pufferrel mossuk és így újból szuszpenzióba visszük, majd 9 700 g gyorsuláson 15 percig centrifugáljuk. A gél-gömböcskékből eluáljuk az enzim-aktivitású frakciókat két egymás után végzett mosással: először 100 ml 10 millimólos kálium-foszfát-pufferrel (pH = 8,0) mossuk, majd 100 ml 20 millimólos kálium-foszfát pufferes (pH = 8,0) mosást alkalmazunk. A két mosófolyadékot egyesítjük (II. lépés). Az eljárás további részét 25 C°-on végezzük. Az egyesített mosófolyadékot DEAE-cellulóz-oszlopra (1,8 cm átmérőjű és 6 cm magasságú) visszük, amelyet előzőleg 20 millimólos kálium-foszfáttal 1. példa (pH = 6,4) [B) puffer] egyensúlyba hoztunk. A mosófolyadékot tartalmazó oszlopot 100 ml B) pufferrel mossuk, majd az enzimet foszfát-pufferrel eluáljuk (lineáris grádiens elúciót végzünk). Ezt a 5 lineáris grádiens elúciót úgy hajtjuk végre, hogy egy keverő edénybe, amelybe eredetileg 200 ml B) puffert töltöttünk, erélyesen belekeverünk 200 ml 200 millimólos kálium-foszfát-puffert (pH = 6,4), olyan sebességgel, hogy a keverő edény- 10 ben a tárfogat állandó maradjon. A legnagyobb enzim-aktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük (III. lépés) és 6,35 mm átmérőjű dializáló edényben 1 órán keresztül 2 liter vízzel szemben dializáljuk. A dialízist megismételjük, majd a dializátumot 15 rávisszük 1,8 x 5 cm-es ECTEOLA-cellulóz-oszlopra, amelyet előzőleg A) pufferrel kiegyensúlyoztunk. A dializátumot tartalmazó oszlopot 100 ml A) pufferrel mossuk. Az enzimet ezután lineáris grádiens elúcióval eluáljuk, a fentiek szerint, keverő 20 edényt alkalmazva, amelyet előzőleg 200 ml A) pufferrel töltöttünk meg, és ebbe töltünk 200 ml 200 millimólos kálium-foszfát-puffert (pH = 8,0), és ezt gravitációs úton beszívatjuk, ahogy az oszlopról történő leoldás előrehalad. Az 25 enzim-aktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük (IV. lépés), és annyi ammónium-szulfátot adagolunk, hogy az enzim 80%-os ammónium-szulfátos szuszpenzióját kapjuk. Ez az eljárás proteinre vonatkoztatva 100-szoro- 30 san megnövekedett fajlagos aktivitást eredményez és a nukleinsavak csaknem teljes eltávolítását teszi lehetővé. A timidin-foszforiláz-aktivitást spektrofotometrikusan határozzuk meg, 290nm-en mérve az 35 abszorpció-csökkenést, amivel a timidin timinné történő foszforilálása jár. 290 nm-nél és 7,4 pH-értéknél a timidinnek magasabb az extinkciós koefficiense, mint a timiné ( = -48 M_1cm_1). A meghatározandó elegy 200 millimólos kálium-fosz- 40 fát-puffert (pH = 7,4) és 1 millimól timidint tartalmaz az egész 2,5 ml-es térfogatban. Egy enzim aktivitási egység az a mennyiség, amely 25 C°-on percenként egy nanomól timin képzését katalizálja timidinből. 45 Az I. táblázat összefoglalja az e példában leírt tisztítás eredményeit. A fenti eljárás 60-szor ismételjük meg, mindig azonos eredménnyel. I. Táblázat Escherichia coli B-96 által képzett timidin-foszforiláz tisztítása Eljárás Lépés száma Térf. (ml) Aktivitási egységek (ml) Teljes egységek száma ftotein mg/ml Aktivitási egységek/mg prot. Term. % Tisztítások száma Ultrahanggal besugárzott felülúszóréteg I 653 106 000 6 943 000 40 2 650 100 __ Eluátum kalciumfoszfátgélről II 206 27 600 4 685 600 0&9 27 880 82 11 4
