173410. lajstromszámú szabadalom • Javított baktériumtáptalajt és timidin-foszforilázt tartalmazó kompozició, baktériumok folsav-antagonistákkal szemben mutatott érsékenységének kimutatására, továbbá eljárás a kombozició és az enzim előállítására
3 173410 4 täten, vagyis 15 /i/ml-nél nagyobb mennyiség esetén a Harper-Cawston-faktor hatása nem elég ahhoz, hogy legyőzze a szulfonamidok és trimetoprim hatásának a megfordítását, megszűnését, valószínűleg azért, mert a timidin hasadása folytán keletkezett timin nagy koncentrációja a hatás-megfordításban képes helyettesíteni a sokkal aktívabb timidint. A Harper-Cawston-faktorról kimutatták [Bushby: Trimethoprim/Sulfamethoxazole in Bacterial Infections: A Wellcome Foundation Symposium. Ed. Bernstein and Salter, Churchill Livingston, Edinburgh and London, 1973, 31-38 old, Bushby, Med. J. Aust. Special Supplement, 1, 10-18 (1973)], hogy ez timidin-foszforiláz. Az utóbb említett publikációban rámutattak arra, hogy „bár a timidin befolyásolja a trimetoprim/szulfametoxazol in vitro hatását, az állatokban általában nem elég nagy koncentrációban van jelen ahhoz, hogy befolyásolja az in vivo hatást”. A ló-vér-lizátumot tartalmazó táptalajnak az egyik hátránya, hogy a táptalajnak vöröses-barna színt kölcsönöz, minél nagyobb mennyiségben van jelen a ló-vér, annál sötétebb a szín. Ez az elszíneződés nem kívánatos, mert nagy mértékben befolyásolja az inkubálás utáni baktérium-növekedés meghatározását. Például folyékony táptalaj esetében a mélyebb szín csökkenti a közeg átlátszóságát, és ily módon pontatlanabbá teszi az optikai sűrűség-méréseket. Szilárd táptalaj esetében csökkenti az agar kontrasztját, ami megnehezíti a gátlási zónák pontos mérését és annak meghatározását, hogy a gátlási zónákban van-e vagy nincs részleges növekedés. Sőt azt mondhatjuk, hogy ha ló-vér-lizátumot kell a baktérium-táptalajhoz adnunk, az azt jelenti, hogy a táptalajt jóformán lehetetlen meghatározni, ami igazán nem-kívánatos jellemző. A ló-vér hasz nálatának másik hátránya, hogy a kereskedelemben nagyon korlátozott mértékben hozzáférhető. Azt találtuk, hogy ha számos, általában használt táptalajhoz izolált és tisztított baktérium-eredetű timidin-foszforiláz-enzimet adunk, úgy ez megjavítja a táptalajokban levő baktériumok érzékenységi próbáját a fólsav-antagonistákkal szemben. A találmány tárgya egyrészt - mint említettük - baktériumok fólsav-antagonistákkal szemben mutatott érzékenysége kimutatására szolgáló kompozíció, mely a baktérium-táptalajt tisztított, baktérium-eredetű timidin-foszforilázzal kombinálva tartalmazza. A timidin-foszforiláz-enzim adagolása számos, a kereskedelemben kapható táptalajnál megnöveli a baktériumok érzékenységi próbáját a fólsav-antagonistákkal, például a szulfametoxazollal és trimetoprimmel szemben. Ilyen táptalaj például a Mueller-Hinton lé és agar [„Supplementary Literature” to the Difco Manual (1972)], Oxoid érzékenységi lé és agar [„The Oxoid Manual” (1971) 3. kiadás, Colab Laboraties Inc. kereskedelmi prospektus), Wellcotest érzékenységi próba agar [Wellcome Foundation Ltd, „Wellcotest Sensitivity Test Agar” (1975)], agy-szív infúziós lé és agar ([„Difco Manual of Dehydrated Culture Media and Reagenst for Microbiological and Clinical Laboratory Procedures” 9. kiadás (1953), ezt a készítményt azért nevezik „agy-szív” készítménynek, mert ez a név egyrészt utal arra, hogy többek között mit tartalmaz — borjú-agyat és marha-szívet, valamint az előállítási móüra (lásd a fenti irodalmat), tripton szója agar [„ Supplementary Literature” to the Difco Manual (1972), a tripton egy pepton, mely albuminátokból keletkezik tripszin hatására]. A timidin-foszforilázt már előzőleg megtisztították az olyan baktériumoktól, mint a Salmonella typhimurium [Archives of Biochem. Biophys. 168, 259-265 (1975)], Bacillus cereus, Baciílus stearothermophilus [J. Biol. Chem. 244, 2691—2697 (1969)], és Haemophilus influenza [J. Bioi. Chem., 246, 6606—6610 (1971)] és főképpen az Escherichia coli-tói, amely a növekedéshez timint és metionint igényel [Schwartz, Eur. J. Biochem. 21, 191-198 (1971)]. Ez az utóbbi tisztítás hosszadalmas eljárást igényel, amely során a nyers enzimet extrahálják a baktérium-tenyészetből, ezután két kicsapási lépés, majd három, különböző típusú oszlopon végzett kromatográfiás lépés következik. Az ily módon izolált enzim-készítmény azonban csak 25-szőr olyan tiszta, mint a nyers sejt-extraktum. Nemrégiben azt találtuk, hogy bizonyos baktériumtörzsek, különösen az Escherichia coli B—96 törzs (ATCC 13473) igen nagy mennyiségű timidin-foszforilázt termel megfelelő növekedési körülmények között, és hogy ezt az enzimet oly módon lehet izolálni, hogy a nyers sejt-extraktumot speciális, kalciumfoszfát-gél adszorbensre visszük fel, adott esetben megismételjük az adszorpciós lépést, ezután csupán két kromatográfiás lépést végzünk és dializálunk. Ez a tisztítási módszer nem csak rövidebb ideig tart és egyszerűbb, hanem a tisztítási effektusa mintegy 100-szorosa a fent ismertetettnek. Ezen túlmenően, ez az új izolálási-tisztítási eljárás alkalmas az enzim nagyipari méretű előállítására. Az Escherichia coli B-96 (ATCC 13473) sokkal több enzimet termel, mint amennyit a ló-vér-lizátum tartalmaz. 1 g ló-vér-lizátum 50 egységnyi timidin-foszforilázt, míg 1 g Escherichia coli B—96 278000 egységnyi enzimet tartalmaz. Ez más szóval azt jelenti, hogy a baktériumos enzim-forrásban 5560-szor több enzim van, mint az emlősből származó forrásban. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi eljárás a baktérium-eredetű tisztított, timidin-foszforiláz előállítására, oly módon, hogy a baktérium-tenyészetből kiextraháljuk a nyers enzimet vizes közegbe, az extraktumot frakcionálási eljárásnak, azaz adszorpciós, kromatográfiás és dialízises lépésnek vetjük alá. Ezt az eljárást az jellemzi, hogy 1.) olyan baktériumot választunk ki, amely megfelelő növekedési körülmények között nagy koncentrációban képes termelni timidin-foszforilázt, és 2.) előnyösen első tisztítási lépésként a kapott nyers sejt-extraktumot kalcium-foszfát-gél-adszorbensre visszük fel, amely ekvivalens mennyiségű kalcium-iont és foszfát-iont tartalmaz. Az eluált anyagot ezután dietilaminoetil-(DEAE)-cellulózra és/vagy cellulóz-epiklórhidrin-trietanolaminra (ECTEOLA-cellulóz) visszük fel, és a DEAE-cellulózról történő eluálás után és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
