173386. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makromolekuláris 4-(nikotinamid-adenin-dinukleotid-N fönt index 6-os)-3-hidroxibutiril-szár,azékok előállítására
173386 4 3 mázhatok továbbá kromatográfiában és nem diffundáló koenzimként. Ily módon vízoldható makromolekulák alkalmazása esetén, ezek vízoldható nem diffundáló makromolekulás koenzimként alkalmazhatók. Ezek kiszélesítik az ismert enzimatikus rendszerek alkalmazási területét, ahol az enzim egy oldhatatlan struktúrába van beágyazva, például szálakba, poliakrilamid gélbe, mikrokapszulákba, amelyek makromolekula-mentesek. Ha az enzim- vagy polienzimetikus rendszert a vízoldható makromolekulás koenzimmel együtt ágyazzuk be, ezek szoros kontaktusban vannak és ily módon a koenzim nem diszpergálódhat a zárt struktúrán kívülre, ami mind ez ideig a koenzim kis molekulsúlya miatt nem volt lehetséges. A vízoldhatatlan makromolekulák kromatográfiában vagy heterogén fázisban lefolytatott enzimatikus reakcióhoz használhatók, ahol a koenzim visszanyerésére is lehetőség van. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban kiviteli példák kapcsán szemléltetjük, anélkül azonban, hogy a példákra korlátoznak. 1. példa A 4-(NAD-N6)-3-hidroxilbutiril-PEI előállítása [(I) általános képletű vegyületben X jelentése polietilénimin (PEI)gyökJ 127 mg 25%-os (súly/térfogat) vizes oldatban levő, 6 pH-jú polietilénimin klórhidrátot (amelyet tömény sósavnak kb. 50 000 molekulasúlyú PEI-hez való adagolásával, majd szárazra párlással állítunk elő), és 0,125 ml desztillált vízben oldott 10 g nikotinamid-6- - ( 2 - h i d r oxi-3-karboxi-propilamino)-purin-dinukleotidot [(II) általános képletű vegyület] majd 0,125 ml piridinben oldott, 10 g N,N’-diciklohexil-karbodiimidet összekeverünk. Az elegyet keverés közien szobahőmérsékleten tartjuk 36 órán át, majd leszűrjük- A szűrletet és a vizes mosások egyesítésével kapott anyagmennyiséget (összesen 10 ml) egy centrifugáló edénybe helyezzük és 10 ml, 6-os pH-jú, 1 mól foszfát pufferrel kicsapjuk. Az anyagot legalább 10 percig centrifugáljuk 39 000 x g-vel és az oldatot dekantálással elválasztjuk a polimer csapadéktól. A polimert tovább tisztítjuk úgy, hogy azt 2 ml, a nátrium-kloridra nézve 2 mól, az acetát pufferte nézve 0,05 mól oldatban, 5,5 pH érték mellett oldjuk; az így kapott oldathoz 8 ml vizet adunk, majd 10 ml 1 mól foszfát pufferrel 6-os pH-nál ismét kicsapjuk, és 10 percig centrifugáljuk 39 000 x g-vel, majd a polimert dekantálással kinyerjük. Ezt a tisztítási eljárást négyszer megismételjük. A terméket NaCl-re nézve 2 mól és acetát pufferre nézve, 0,05 mól oldatban, 5,5 pH értéknél ismét feloldjuk, dializáló vizsgáló csőbe helyezzük és 24 órán át 250 ml, NaCl-re nézve 10-4 mól oldat ellenében dializáljuk. Ugyanezt az anyagot ezután 250 ml 10—4 mól HC1 oldat részleteivel dializáljuk 4 napig, az oldatot naponta cseréljük, és a dializáló csőben visszamaradt terméket liofilizálással kinyerjük. így 90 mg polimert kapunk, amelynek Xmax értéke 266 mp-nál van. A polimerhez kovalens módon kötött NAD meghatározása aktív koenzimként, a polimer vizes oldatában 2 történik, 0,16 mól Tris-pufferben levő 9 pH-jú élesztőből kapott alkohol dehidrogéngázzal végzett kvantitatív enzimatikus redukcióval, 0,5 mól etilalkohol és 0,075 mól szemikarbazid-klórhidrát jelenlétében. A NADH 340 mp hullámhossznál végzett spektrofotometriás mérése kimutatta, hogy polimer grammonként, enzimatikusan redukálható módon, 28,5 pmól NAD mennyisége van megkötve. Az ily módon kapott makromolekulás NAD, a természetes NAD-hoz viszonyítva, különböző dehidrogenázok jelenlétében jelentős koenzim aktivitást mutat. Például patkány izomból származó tejsav dehidrogenáz jelenlétében a természetes koenzimre vonatkozóan 557í>os specifikus aktivitási szintet mutat. A meghatározást 0,1 mól ammónia-karbonát pufferban 8,5 pH-értéknél, 25 °C-on végeztük. 2. példa A 4-(NAD-N6)-3-hidroxibutiril-PEI előállítása [(I) általános képletű vegyidet, ahol X jelentése polietilénimin (PEI) gyök] Az 1. példában említett módon kapott 126 mg PEI 25 súly/térfogat %-os, 6-os pH-jú vizes oldatát 0,5 ml vízben oldott 40 mg nikotinamid-6-(2-hidroxi-3-karboxipropilamino>purin-dinukleotiddal [(II) általános képletű vegyület] keverjük, majd 0,5 ml vízben oldott 40 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-klórhidiátot adunk hozzá. Az elegy pH értékét 1 mól nátrium-hidroxiddal 5,5-re állítjuk. Az elegyet keverés közben 48 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Az oldathoz annyi vizet adunk, hogy össztérfogata 10 ml legyen, majd centrifuga edénybe helyezzük és 10 ml 6-os pH-jú 1 mól foszfát pufferrel kicsapjuk. Az anyagot 10 percig centrifugáljuk 39 000 x g-vel és az oldatot elválasztjuk a polimer csapadéktól. A polimer további tisztítása céljából 2 ml 2 mól NaCl és 0,05 mól acetát puffer oldatában, 5,5 pH értéknél feloldjuk; az ily módon kapott oldathoz 8 ml vizet adunk és ismét kicsapjuk 10 ml 6-os pH-jú 1 mól foszfát puffer segítségével; ezután 10 percig 39 000 x g-vel centrifugáljuk, és a polimert dekántálással kinyerjük. Ezt a tisztítási eljárást négyszer végezzük el. A terméket NaCl-re nézve 2 mól és acetát pufferre nézve 0,05 mól, 5,5 pH-jú oldatban ismét feloldjuk, majd dializáló edénybe helyezzük, és 24 órán át 250 ml NaCl-re nézve 2 mól, HCl-re nézve 10—4 mól oldatban dializáljuk. Ezután 250 ml 10—4 mól HC1 oldat részleteiben 4 napig dializáljuk, az oldatot naponként cseréljük, és a dialízis edényben visszamaradt terméket liofilizálással kinyerjük. 85,7 mg polimert kapunk, amelynek Xmax értéke 266 mii. A polimerhez kovalensen kötött NAD aktív koenzimként történő meghatározása a polimer vizes oldatában történik, kvantitatív enzimatikus redukció útján, 0,15 mól 9 pH-jú Tris pufferben levő élesztőből származó alkohol-dehidrogenáz segítségével, 0,5 mól etilalkohol és 0,075 mól szemikarbazid jelenlétében. A képződött NADH származék spektrofotometriás mérése 340 mji-nál kimutatta, hogy polimer grammonként 125 fim enzimatikusan redukálható NAD mennyisége van megkötve. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
