173386. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makromolekuláris 4-(nikotinamid-adenin-dinukleotid-N fönt index 6-os)-3-hidroxibutiril-szár,azékok előállítására
5 173386 3. példa A 4(NAD-Né)-3-hidroxibutiril-PLYS előállítása [(I) általános képletű vegyidet, ahol X jelentése poli-L-lizin (PLYS) gyök] 5 1 ml vízben oldott 100 mg poli-L-lizin-brómhidrátot, amely kb. 50 000 molekulasúlyú, 0,5 ml vízben oldott 40 mg nikotin-amid-6-(2-hidroxil-3-karboxi-propdamino)-purin-dinukleotiddal [(II) általános képletű vegyidet] keverünk, majd 0,5 ml vízben ol- 10 dott 40 mg N-etil-N’-(3-dímetílamino-propil)-karbodiimid klórhidrátot adunk hozzá. Az elegy pH-ját 1 mól NaOH-val 5,5-re állítjuk be. A reakcióelegyet keverés közben 48 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. 15 Az elegyet ezután egy dializáló edénybe behelyezzük és 250 ml, nátrium-kloridra nézve 2 mól és sósavra nézve 10—4 * mól oldatban 24 órán át dializáljuk. Ezután 250 ml 10—4 mól sósavoldat részleteivel 4 napig dializáljuk, az oldatot naponta cseréljük; a diali- 20 záló edényben visszamaradt terméket liofilizálássa1 nyerjük ki. így 75,4 mg polimert kapunk, Xmax érték 266 m/i-A poli-L-lizinhez kovalensen kötött, a koenzim szempontjából aktív NAD meghatározása spektrofo- 25 tometriásan történik, a polimer enzimatikusan kvantitatív redukciója után 9 pH-jú 0,15 mól Tris-pufferben levő élesztőből kapott alkohol dehidrogenáz segítségével, 0,5 mól etilalkohol és 0,075 mól szemikarbazidklórhidrát jelenlétében, a képződött NAD származé- 30 kot 340 m/r-nál meghatározva. Ebből a polimer grammonként kovalensen kötött enzimatikusan redukálható NAD mennyisége 90 /uniói. 4. példa A 1 -(NAD-N6 >3-hidroxibutiril-AHSEPH előállítása [(I) általános képletű vegyület, ahol X jelentése gél ml-ként 6—10 mól amino maradékot tartalmazó 40 Sepharose 4B gyök, amelyet a cianogén-bromidos módszer segítségével 1,6-diaminohexánnal készítünk el (AHSEPH)]. 500 mg AHSEPH-t (kereskedelmi név AH-Sepharose 4B) duzzasztunk 0,5 mól nátrium-klorid oldatban, 45 majd 200 ml 0,5 mól nátrium-klorid oldattal, utána desztillált vízzel mossuk. Amikor a gél eléri a kb. 2 ml térfogatot, 2 ml desztillált vízben oldott 92 mg nikotinamid-6-(2-hidroxi-3-karboxi-propilamino>purin-dinukleotidot [(II) általános képletű vegyület] adunk 50 hozzá, és a pH-t 1 mól nátrium-hidroxiddal 5-re állít-6 juk. A szuszpenziót szobahőmérsékleten, mechanikus keverővei, lassan keverjük, és ezután cseppenként 2 ml desztillált vízben oldott 75 mg N-etil-N’-(3-dímetílamino-propil>karbodiímid klórhidrátot adunk hozzá. Az első 5 óra folyamán 5 pH értéket kel] tartanunk sósav hozzáadásával, és a lassú keverést továbbra is fenntartjuk. A reakciót 25 órán keresztül végezzük, majd a gélt leszűrjük és mossuk, először 200 ml nátrium-kloridra nézve 1 mól és sósavra nézve 10—4 mól oldattal, majd desztillált vízzel, hogy kb. 1,8 ml nedves gélt kapjunk, Amax értéke 266 m/u. A Sepharose gélhez kovalensen kötött NAD tartalmat spektrofotométeres méréssel határoztuk meg, a koenzimre nézve oxidált formában (NAD) 266 mp-nál és a 9 pH-jú 0,15 mól Tris pufferben levő élesztőből kapott alkohol-dehidrogenázzal enzimatikusan redukált koenzimre nézve (NADH) 340 mp-nál 0,5 mól szemikarbazid klórhidrát jelenlétében. Az ultraibolya spektrum mérése 1% Polyox WSR 301-t (mely a gél ülepedését lassítja) tartalmazó vizes oldatban szuszpendált gélben történik. A 266 mp-nál végzett optikai sűrűségmérésből látható, hogy száraz Speharose grammonként a kovalensen kötött összes NAD mennyisége 2,04 pmól. Az enzimatikus redukcióból és a 340 mp-nál végzett optikai sűrűség mérésekből kapott eredmény száraz Sepharose gél grammonként 1,15 pmól, a polimerhez kovalensen kötött, enzimatikusan redukálható NAD mennyiséget mutatott. Szabadalmi igénypont Eljárás az (I) általános képletű, makromolekulás 4 - (n i k o t i n a m i d - a d e n i n-din ukleotid-N6 )-3-hidro xibutiril-származékok előállítására, ahol a képletben R’ jelentése ribózcsoport és X jelentése a — ^ — csoporthoz egy nitrogénatomján keresztül kepcsolódó polietilénimin-, polilizin vagy gél ml-enként 4—12 mól amino maradékot tartalmazó agaróz, azzal jellemezve, hogy valamely (II) általános képletű kiindulóanyagot - ahol R’ jelentése a tárgyi körben megadott, polietiléniminel vagy polilizinnel vagy gél ml-enként 4—12 mól amino-maradékot tartalmazó agarózzal reagáltatunk, karbodiimid kondenzálószer, előnyösen N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid klórhidrát vagy N,N’-diciklohexil-karbodümid jelenlétében és a reakciót vízben, vagy víz és szerves oldószer elegyében végezzük, a reakcióhőmérsékletet pedig 5-50 °C-on, előnyösen szobahőmérsékleten tartjuk. 1 lap rajz A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 79.7943.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató 3
