173275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ß-amiláz és Ó-1,6-glükozidáz előállítására
g 173275 10 a— 1,6-glükozidos kötéseit, aminek során ajód-vizsgálat közben kék színreakciót adó amilózszerű anyag keletkezik [Biochemische Zeitschrift, 334. kötet, 79-95. oldal (1961), Biochem. J„ 108, 33-40 (1968), Biochimica of Biophisica Acta, 212, 458-469 (1970), J. Fermentation of Technology. 49. 552-559 (1971) stb.]. Általában azért az enzimek mérését úgy végezzük, hogy miközben az enzimmel keményítőt vagy amilopektint hidrolizálunk, mérjük a jód-festési reakció intenzitásának növekedését. A találmány szerinti eljárás során baktériumokkal előállított a—1,6-glükozidáz alig növeli a jód-festési reakció intenzitását, ha keményítőt vagy amilopektint hidrolizálunk vele. Ez a tény azt jelenti, hogy a jelen enzim csak akkor reagál a keményítővel vagy az amilopektinnel, ha ezek oldalláncát bizonyos mértékig például ß-amiläzzal már előzőleg hidrolizáltuk, és az oldallánc glükóz-csoportja lehasadt. Ez a szubsztrát -fajlagosság az egyik olyan tulajdonság, amelynek alapján megkülönböztethető a találmány szerinti eljárással előállított enzim az ezideig ismert mikroorganizmusokkal előállított a— 1,6-glükozidázoktól. így a találmány szerinti eljárás során használt, a Bacillus genus-ba tartozó törzsekkel előállított a—1,6-glükozidáz igen előnyös enzimatikus tulajdonságokkal rendelkezik, amennyiben az enzim együtt hatva az azonos időben szintetizálódó ß—amilázzal, a keményítőt közvetlenül maltózzá hidrolizálja. Ahogy az az 1—4. ábrákból kiderül, a két enzim nem csak a hatásuk pH-függése és a pH-optimumuk tekintetében hasonlítanak teljesen egymáshoz, de a hatásuk hőmérséklet-függése és a hőmérséklet-optimumuk szempontjából is. Nagymértékben hasonlítanak egymáshoz pH-állandóságuk és hőállandóságuk tekintetében is. A hidrolízis módja szempontjából vizsgálva a két enzimet: a /3-amiláz a keményítő amilopektinjét a lánc nem redukáló végétől kiindulva maltózokra hasítja, majd ahogy a reakció előrehalad az elágazások felé, a találmány szerinti eljárással előállított a—1,6-glükozidáz hatása révén felhasad az elágazás a—1,6-glükozidáz kötése. így a két enzim, a ß-amiläz és az a—1,6-glükozidáz a nem redukáló végektől kiindulva váltakozva hidrolizálja az amilopektint és a maltóz-egységeket. Ahogy az a reakció mechanizmusából kiderül, ha a találmány szerinti eljárással előállított enzimet a (3-amilázzal együtt használjuk, úgy magasabb kitermeléssel kapunk maltózt, mint ha az ezideig ismert a-1,6-gIükozidázokat használjuk. A kitermelés megközelíti az elméleti termelést, a 90—96 %-ot. Ha ezideig ismert enzimet, mint pullulanázt vagy izo-amilázt használunk, az enzim a keményítővel reagálva hasítja az amilopektin elágazásait, amikor egyenes láncú amilóz-szerű anyagot kapunk, amit ezután ß—amilázzal reagáltatunk a maltóz előállítására. Leírják, hogy ezzel a folyamatos, két lépésből álló eljárással a maltóz kedvező kitermeléssel állítható elő. Ha a találmány szerinti eljárással előállított enzimeket használjuk, nehéz ezzel a kétlépeses reakcióval jó kitermeléssel maltózt előállítani. Ahogy az előzőekben közöltük, a találmány szerinti eljárás során a ß-amiläz és az a-1,6-glükozidáz váltakozva reagál, és maltózt kapunk igen jó kitermeléssel. Az élesztőkből és a Pseudomonas nembe tartozó mikroorganizmusokból elkülönített izo-amiláztól eltérően a találmány szerinti eljárással előállított enzimek hidrolizálják a pullulán a—1,6-glükozidos 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 kötéseit, majd ezután bekövetkezik a pullulán teljes hidrolízise maltotriózra. Az enzimeket természetesen felhasználhatjuk a pullulánból való maltotrióz előállítására. A végtermékben glükóz, maltóz vagy oligoszacharid nincs jelen. Az ebben az esetben lejátszódó hidrolízis módja abból a megfigyelésből kiindulva, hogy a maltotrióz a reakció kezdeti szakaszában keletkezik, oxo-típusűnak nyilvánítandó. Az enzimekkel katalizált reakció vizsgálataink szerint nem visszafordítható. Ezzel szemben a pullulánnak az Aerobacter és a Streptococcus nembe tartozó mikroorganizmusok által termelt pullulanázzal való hidrolízisekor glükóz, maltóz, maltotreóz és még nagyobb oligoszacharidok, mint maltotrióz keletkezését figyelték meg [Biochemische Zeitschrift, 334, 79-95 (1961)], és a visszafordított reakció során a maltotriózból hat szénatomos vegyületek, míg a maltózból négy szénatomos vegyületek jönnek létre [Nature, 2Î0, 200 (1966), Archives of Biochemistry and Biophysics, 137, 483—493 (1970), Biochemical J„ 108, 33-^0 (1968) stb.]; ez azt jelenti, hogy a pullulán teljes hidrolízise maltotriózzá nem érhető el. Ahogy azt az előzőekben már megadtuk, a találmány szerinti eljárással előállított enzimek erőteljesen hasítják a glükóz-csoportok rövid oldalláncát, és képtelenek hidrolizálni az izo-maltóz, pannóz és izo-maitotrióz a—1,6-glükozidos kötéseit. Ezen megfigyelés alapján az enzim különbözik az állati eredetű oligo-1,6-glükozidáztól [J. Biol.Chem. 215, 723-736 (1955)]. A találmány szerinti eljárással előállított a—1,6-glükozidáz szubsztrát-specifitása, amely bármelyik enzim egyik legfontosabb tulajdonsága, lényegesen különbözik az ezideig ismert izoamiláz és pullulanáz szubsztrát-specifitásától. Tény, hogy a találmány szerinti eljárással előállított a—1,6-glükozidáz csak egyirányú reakciót katalizál. így az enzim különbözik az ezideig ismert pullulanáztól vagy izoamiláztól. Emellett ennek az enzimnek a hőinaktiválódása Ca-ionokkal pótolható, ami nem figyelhető meg a pullulanáz és az izoamiláz esetében. Másrészről, az Aerobacter és a Streptococcus nembe tartozó baktériumokból nyert pullulanáz kapcsán hőinaktiválódás után megfigyelt aktivitás-visszanyerés jelenség nem figyelhető meg a találmány szerinti eljárással előállított enzimmel. Ez a jelenség arra utal, hogy a találmány szerinti eljárással előállított enzim a fehérjetermészetű tulajdonságok tekintetében különbözik az Aerobacter és Streptococcus nemből elkülönített pullulanáztól stb. A találmány szerinti eljárással előállított enzim pH-optimuma, ahogy az az 1. ábrából kiderül, a semleges pH-tartományba, míg ahogy az a 2. ábrán látható, a hatása szempontjából optimális hőmérséklet 50 C° körüli értékre esik. A pH- és hőmérséklet-igény tekintetében a találmány szerinti eljárással előállított enzim különbözik az Aerobacter nembe tartozó baktériumokkal előállított pullulanáz [pH-optimuma 5,0, hőmérséklet-optimuma 47,5 C°; Biochemische Zeitschrift, 334. 79-95 (1961)], a Streptococcus nembe tartozó baktériumokkal előállított pullulanáz [pH-optimuma 5,4-5,8 hőmérséklet-optimuma 30 C°; Biochemical J. 108, 33—40 (1968)], továbbá az élesztőből előállított izoamiláz [pH-optimuma 6,0—6,2, hőmérséklet-optimuma 20 C°; J. Agricultural Chem. Soc., 23, 155 és 120 5
