173275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ß-amiláz és Ó-1,6-glükozidáz előállítására
11 173275 12 (1949)] és a Pseudomonas nembe tartozó baktériumokkal előállított izoamiláz [pH-optimuma 3-4, hőmérséklet-optimuma 52 C°,‘ Biochimica et Biophysica Acta 212, 458—469 (1970)] pH- és hőmérséklet-optimumától . A találmány szerinti eljárással a megadott baktériumok tenyésztésével nyert tenyészlé szűrle te, a tömény szűrlet, a szerves oldószenei vagy az ammóniumszulfáttal elkülönített csapadék egyaránt tartalmazza a /3-amilázt és az a—1,6-glükozidázt, és így enzim-készítményként mind használható a keményítőből stb. való maltóz-előállítására. A /3-amiláz és az a—1,6-glükozidáz ebből az enzim-készítményből egymástól függetlenül frakcionálható oly módon, hogy a folyadékot ammóniumszulfáttal 30—50%-osan telítjük, amikor kiválik az oldatból a 0-amiláz, majd a folyadék 60—70%-os ammóniumszulfátos telítésekor kiválik az oldatból az <*— 1,6-glükozidáz. Az elkülönített /3-amiláz és az a—1,6-glükozidáz Sephadex oszlopkromatográfiásan nagymértékben tisztítható. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban példákkal szemléltetjük. A példák, érthetően, a találmány oltalmi körét nem szűkítik. 1. példa 200 ml-es Erlenmeyer-lombikba 50 ml, a következő összetételű táptalajt öntünk: Pepton 1 % k,hpo4 0.3% MgS04'7H:0 0.1 % Maltóz 1 % A szokászos módon. 121 C° hőmérsékleten. 15 percen át sterilezzük a táptalajt, majd Bacillus cereus var. mycoides-szel (FERM No. 2391) oltjuk. Két napon át 30 C° hőmérsékleten folytatjuk a tenyésztést. Ezután a sejtek eltávolítására centrifugáljuk a tenyészetet. A felülúszó enzim-tartalmát meghatározzuk. az 628 egység /3-amilázt és 18 egység a-1,6-glükozidázt tartalmaz milliliterenként. Cellofán zsákba helyezzük a felülűszót, és az át nem alakult cukor eltávolítására desztillált vízzel szemben dializáljuk. A dializált enzim egy részét ( 204 egység /3-amiláz és 3,6 egység a-1,6-glükozidáz) 7-es pH-n, 40 C° hőmérsékleten összesen 4,3 ml térfogatú reakcióelegyben 0,4 % koncentrációban jelenlévő burgonya•amilózzal. amilopektinnel, burgonyakeményítővel, glikogénnel és dextrinnel reagál tatjuk. Adott időközönként a reakcióelegyből minden esetben azonos mennyiségű mintát veszünk, a minták redukáló cukor-tartalmát pedig Somogyi és Nelson módszerével meghatározzuk. A reakcióelegy cukor-összetételét papírkromatográfiásan határozzuk meg, a futtatást piridin, butanol és víz 463 elegyével végezzük. A mérési eredményekből kiderül, hogy ha szubsztrátként amilózt, amilopektint vagy burgonyakeményítőt használunk, a keletkező cukor majdnem teljes mértékben (90-96 %) maltózt, továbbá igen kis mennyiségű (4-8%), a maltotrióznak megfelelő Rf-értékű cukor jelenléte is kimutatható. A Worthington Biochemical Corporation; USA Glukostat-jával végzett mérés eredménye szerint a reakcióelegy ben rendkívül kismennységü, kevesebb mint 0,1 % glükóz keletkezett. Az eredményeket az 5. ábrán adjuk meg. Az ábrából látható, hogy 8 óra alatt a vizsgált burgonya-amilóz, amilo-pektin, dextrin és burgonyakeményítő mindegyike gyakorlatilag teljes mértékben maltózzá hidrolizálódott. A glikogén 23 órai reagálás során 90 %-ban maltózzá hidrolizálódott. 2. példa Az 1. példában megadott összetételű táptalajt Bacillus sp. YT—No. 1002 (FERM No. 2837) törzzsel oltjuk, majd 30 C° hőméréskleten rázatjuk a tenyészetet. 48 órás tenyésztés után méijük a tenyészlé enzim-tartalmát, ez milliliterenként 121 egység /3-amiláz és 10,5 egység a-l,6-glükozidáz. 3. példa Az 1. példában megadott összetételű táptalajt Bacillus sp. YT—No. 1003 (FERM No. 2838) törzzsel oltjuk, majd 48 órán át 30 C° hőmérsékleten rázatjuk a tenyészetet. Ezután meghatározzuk a tenyészlé enzim-tartalmát, ez milliliterenként 152 egység /3-amiláz és 5,3 egységo-l,6-glükozidáz. 4. példa 1 literes lombikba 250 ml, a következő összetételű táptalajt töltünk: Polipepton 1 % K2HP04 0,3% MgS04 -7H20 0,1% Dextrin 1 % Ismert eljárással sterilezzük a táptalajt, majd Bacillus cereus var. mycoides-szel oltjuk. Ezután 48 órán át 30 C° hőmérsékleten rázatjuk a tenyészetet. A tenyésztés befejeződése után a sejtek eltávolítására centrifugáljuk a fermentlevelet, a felülúszó enzimaktivitását megmérjük. A mérés eredményei szerint a felülúszó milliliterenként 420 egység /3-amilázt és 7,8 egység a-1,6-glükozidázt tartalmaz. A feiüiúszó 200 ml-ét 75 %-osan ammóniumszulfáttal telítjük, a kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük, és kevés vízben oldjuk. Meghatározzuk az oldat enzimaktivitását. Az oldat milliliterenként 83 000 egység /3-amilázt és 952 egység a-1,6-glükozidázt tartalmaz. 5. példa Az 1. példában megadott eljárással előállított enzimoldat egy részét (10 000 egység /3-amiláz és 275 egység a—1,6-glükozidáz) 1 g, 1 %-os koncentrációban jelenlévő amilopektinnel reagál tatjuk 5 x 10 mól CaCl3 jelenlétében. A reakciót 40 Cö hőmérsékleten végezzük, az elegy pH-ját 7-re állítjuk be. Somogyi és Nelson módszerével meghatározzuk a reakcióelegy redukáló cukor-tartalmát. A mérések eredménye szerint az elegy 972 mg maltózt tartalmaz, glükóz-tartalma 3,7 mg. A papírkromatográfiás vizsgálat szerint a termék a maltózt és igen kis mennyiségű maltótriózt tartalmaz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 GO I 65 6
