173275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ß-amiláz és Ó-1,6-glükozidáz előállítására
7 173275 8 Az adszorbeálódott ß-amiläz a keményítőről 1 —10%-os, előnyösen 5—10%-os maltóz oldattal, vagy oldható keményítőt, dextrint vagy maltózt tartalmazó oldattal teljes mértékben eluálódik. Aktív szénen a ß-amiläz és az a—1,6-glükozidáz js jól adszorbeálódik. Az adszorbeált enzimek erős enzimaktivitással rendelkeznek, így rögzített enzimként használhatók. így például a ß-amiláz 8000-12000 egység, az a-1,6-glükozidáz 500-1000 egységig aktív szén mennyiségben adszorbeálódik. Az adszorbeált enzimek közül a ß-amiläz eredeti aktivitásának 90 %-át, míg a glükozidáz eredeti aktivitásának 100 %-át tartja meg. Ezenkívül, az a—1,6-glükozidáz jól adszorbeálódik (500—800 egységig) diatomaföldeken, például Celiten, Perliten stb. (ezek szüicium-alapú anyagok), vagy agyagon, például bentoniton, savas agyagon vagy Kaoliniten (ezek túlnyomórészt szilicium-alumínium-alapú anyagok), az adszorbeálódott enzim 5—10%-os vizes nátriumklorid oldattal teljes mértékben eluálható. Az enzim ugyanakkor még adszorbeálódott állapotban is kifejti eredeti aktivitásának 50—70 %-át. A találmány szerinti eljárás során használt baktériumok által termelt ß-amiläz és a—1,6-glükozidáz enzimatikus tulajdonságait a következőkben adjuk meg. ß-amiläz : 1. Hatás: az enzim keményitőből. amilózból, amilopektinből. glikogénből, dextrinből stb. maltózt készít. 2. Szubsztrát-fajlagosság: az enzim az amilózt közel 100 % -osan. míg a keményítőt közel 60%-osan maltózzá hidrolizálja. Az enzim nem hidrolizálja az amilopektinben, glikogénben, dextrinben. pullulánban stb. lévő a-1,6-glükozidos kötéseket. 3. A hatás pH-függése: pH 3-10 (1. ábra). 4. pH-optimum: pH 7 közelében (1. ábra). 5. A hatás hőmérséklet-függése: 65 C°-ig (2. ábra). 6. Hőmérséklet-optímum: 50 C° közelében (2. ábra). 7. Inaktiváció: ha az enzimet 10 percen át 55 C° hőmérsékleten tartjuk, aktivitásának körülbelül 20%-a elvész. Gyakorlatilag teljes aktivitás-veszteség tapasztalható, ha az enzimet 10 percen át 70 Co hőmérsékleten hagyjuk állni. 8. pH-állandóság: pH-5-nél kisebb értéken az enzim nem állandó, míg pH—6—10 között állandó. 9. Gátlás: az enzimet a p-klórmerkuri-benzoát gátolja, míg a monojódecetsav kevéssé gátolja. A p-klórmerkuri-benzoát által kiváltott gátlás cisztein adagolásával felfüggeszthető. Az enzimet Cu**—, Hg” - és Ag*-ionok szintén erősen gátolják. Megfigyelhető a Fe**-ionok okozta gátlás is. 10. Tisztítása: az enzimet a tenyészléből 30-50'/-os ammóniumszulfátos frakcionált kicsapással különítjük el. majd Sephadex G-100 gyantából készült kromatografáló oszlopon tisztítjuk. 11. Az enzimaktivitás mérése: megfigyelhető mennyiségű enzimoldatot 2 ml, 2% oldódó keményítőt tartalmazó, 0,1 mólos pH 7,0-es foszfát-pufferhoz adunk, az elegy térfogatát ezután desztillált vízzel 4 ml-re egészítjük ki. 40 C° hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd meghatározzuk maltóz-tartalmát. 1 egységnyi az az enzim-mennyiség, amely egy óra alatt, a megadott reakciókörülmények között 1 mg maltózt hasít. a—1,6-glükozidáz 1. Hatás: az enzim hidrolizálja az amüopektin a-l,6-glükozidos kötéseit, amely molekulát a ß-amiläz részben már hidrolizált. 2. Szubsztrát-fajlagosság: az enzim a pollulan a-l,6-glükozidos kötéseit hidrolizálva maltotriózt állít elő. Ha az enzim hatásának az amilopektint tesszük ki, nem tapasztaljuk a jódfestődési próba erősségének növekedését. Ebből arra következtetünk, hogy az enzim hatását a ß-amiläz által megrövidített oldalláncokkal rendelkező amüopektinnel szemben fejti ki. Ugyanakkor az enzim nem hasítja az izo-maltózt és a pannózt. 3. A hatás pH-függése: pH 5 10(1. ábra) 4. pH-optimum: pH 6—6,5 (1. ábra). 5. A hatás hőmérséklet-függése: 65 C°-ig (2. ábra). 6. Hőmérséklet-optimum: 50 C° közelében (2. ábra). 7. Inaktiváció: ha az enzimet 10 percen át 50 C° hőmérsékleten tartjuk, úgy aktivitásának körülbelül 50 %-át elveszti. Gyakorlatilag teljes aktivitás-veszteség tapasztalható, ha az enzimet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten hagyjuk állni (4. ábra). Az inaktiválódás ellen a Ca++ és a Sr++-ionok védik az enzimet. A kalciumionok jelenléte nélkül az enzim aktivitásának körülbelül 90 %-át veszti el, ha 30 percen át 50 C° hőmérsékleten hagyjuk állni. 5‘10~3 mól CaClj jelenlétében az aktivitás-veszteség alig észlelhető. 8. pH-állandóság: az enzim 6 és 9 pH-értékek között állandó. Az enzim bomlik savas és viszonylag állandó lúgos pH-tartományban (3. ábra). 9. Gátlás: az enzimet p-klórmerkuri-benzoát gyengén, míg monojódecetsav nagyon kevéssé gátolja. Ugyanakkor erős enzimgátlás figyelhető meg Hg++- és Ag++-ionok jelenlétében. Az enzimet Fe**-ionok is gátolják. 10. Tisztítás: a tenyészléből 60—70%-os ammónium-szulfáttal frakcionáltan kicsapjuk az enzimet, majd Sephadex G-100 gyantából készült kromatografáló oszlopon tisztítjuk. 11. Az enzimaktivitás mérése: szubsztrátként pullulant használunk, és a reakcióhoz a következő körülményeket biztosítjuk. Az enzim pullulánból maltotriózt hidrolizál. 0,5 ml, 1 % pullulánt tartalmazó 0,1 mólos, 7,0-es pH-jú pufferhoz megfelelő mennyiségű enzimet adunk. Desztillált vízzel 1,0 ml térfogatúra töltjük fel az elegyet. Ezt egy órán át 40 ('^hőmérsékleten inkubáljuk. 1 egységnyi az az enzim-mennyiség, amely a fentiekben megadott körülmények között 1 mg maltotriózt hasít a pullulánból. A fentiekben ismertetett fizikai és kémiai tulajdonságok, különösen a szubsztrát-fajlagosság alapján a Bacillus nem által szintetizált enzim egy új a-l,6-glükozidáznak nyilvánítható, amely nem sorolható az ezideig ismert enzimekhez, az izo-amilázhoz vagy a pullulánhoz. Az enzim mint dextrin-a-1,6-glükozidáz írható le. A jelen találmányban ismertetett eljárás felfedezéséig ismert mikroorganizmusok által termelt a-1,6-glükozidázok (izo-amiláz és pullulanáz) változás nélkül hidrolizálják az amilopektin oldalláncának 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
