173275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ß-amiláz és Ó-1,6-glükozidáz előállítására
5 173275 6 Növekedési hőmérséklet: 30 C° és 35 C° közötti hőmérsékleten optimális a növekedés. 45 C° hőmérséklet fölött nem látszik növekedés. Izolálás helye: földminta. A találmány szerinti eljárás során használt baktériumfajok, ha azokat a mikroorganizmusok tenyésztésekor általánosan használt szén- és nitrogénforrásokat tartalmazó táptalajon tenyésztjük, változás nélkül termelik mind a (3-amilázt, mind az a—1,6-glükozidázt. Szénforrásként használható például maltóz, keményítő, részben hidrolizált keményítő, mint például dextrin és más keményítő-származékok. Nitrogénforrásként például peptont, kazeint, húskivonatot, kukoricalekvárt, szójabablisztet vagy szójapogácsát használunk. Szükség esetén kiegészíthetjük a fenti nitrogénforrásokat, szervetlen sókat, például foszfát-, magnézium-, bárium- és kalciumsókat, továbbá szervetlen nitrogénforrást adhatunk a táptalajhoz. Ha a táptalajhoz kukoricalekvárt adunk nyersanyagként, úgy használata előtt előnyösen 6 és 9 közötti értékre állítjuk be a pH-ját és eltávolítjuk a /3-amiláz termelést gátló anyagot tartalmazó csapadékot. Az 1. táblázatban közölt adatokból világosan látszik, hogy a keletkező /3-amiláz mennyisége több mint tízszer nagyobb, ha a kukoricalekvár gátló frakcióját eltávolítjuk, és kiderül az is, hogy ez az előkezelés az a—1,6-glükozidáz termelését csak igen kis mértékben befolyásolja. 1. táblázat A kukoricalekvár keze. /3-amiláz a—1,6-glükozidáz lése különböző pH-ér(egység ml. (egység/ml táptékeken táptalaj ) talaj) Nem kezelt 40 35,4 pH 5,1 ± 0,1 121 40,6 pH 6,0 ±0,1 420 39,1 pH 7,1 ± 0,1 516 41,3 pH 8,1 ±0,1 525 35,9 pH 9,1 ± 0,1 460 35,1 pH 10,0 + 0,1 352 25,0 A két enzim termelésének növelésére a feltalálók részletesen vizsgálták a tenyésztés körülményeit. Ügy találtuk, hogy ha a táptalajba mangánionokat adunk, úgy az a— 1,6-glükozidáz termelése jelentősen nő. Ugyanakkor a mangánionok a /3-amiláz termelését inkább gátolják, ügy találtuk, hogy ha a mangánionokra disszociáló sót megfelelő időben és megfelelő mennyiségben adjuk a táptalajhoz, úgy a tenyésztés úgy kivitelezhető, hogy megfelelő mennyiségű /3-amiláz ésa-l,6-glükozidáz termelődjön. Mangánsóként különböző mangánvegyületeket használhatunk. így adhatunk a táptalajhoz mangánkloridot, mangánszulfátot, mangánfoszfátot vagy mangánacetátot. Ezeket a mangánsókat általában olyan mennyiségben adjuk a táptalajhoz, hogy az 1 "10—8 és 1'10-2,előnyösen 1'10-6 és 1 ' 10— 4 mól közötti mennyiségű sót tartalmazzon. Ha például 1 ‘ 10— s mól mangánszulfátot tartalmazó táptalajon végezzük a tenyésztést, úgy az a—1,6-glükozidáz termelése 3—6-szorosára nő a mangánsót nem tartalmazó táptalajon elérhetőhöz képest. A két enzim előállítása kapcsán megfigyeltük, hogy ha a tenyésztést citrátot és/vagy tartarátot tartalmazó táptalajon végezzük, úgy mind a /3-amiláz, mind az a-1,6-glükozidáz termelése nő. A citrátot vagy a tartarátot általában 0,01 % és 1 % közötti, előnyösen 0,05 % és 0,2 % közötti mennyiségben adjuk a táptalajhoz. Abban az esetben, ha a tenyésztést a táptalajra számítva például 0,1 % mennyiségű nátriumcitrát vagy nátrium tártára t jelenlétében végezzük, úgy a termelt /3-amiláz mennyisége 1,5 — 2-szer, míg az a— 1,6-glükozidáz mennyisége 1,3 — 1,5-ször nagyobb, mint ezen sók nélkül. Ezenfelül úgy találtuk, hogy ha a tenyésztő táptalajba repcemagvakat, repcemagból készült pogácsát vagy repce-extraktumot (a repcemagvakat 9—10 közötti pH-jú lúgos vízben vagy folyadékban főzzük) adunk, úgy különösen az a-1,6glüközidáz mennyisége nő a táptalajban jelentősen. Ha például a táptalaj 4% repcemag-pogácsát tartalmaz, úgy a termelt a— 1,6-glükozidáz mennyisége 2—3-szorosára nő. A baktériumok tenyésztését aerob körülmények között, 20 C° és 40 C° közötti hőmérsékleten 24-72 órán át végezzük. A tenyésztés során a táptalaj pH-ja 5,5 és 9,5 között változik. Előnyös, ha a táptalaj pH-ját a tenyésztés egész ideje alatt 6 és 8 közötti értéken tartjuk. Mind a /3-amiláz, mind az a—1,6-glükozidáz extracellulárisan keletkezik. A tenyésztésben lévő enzimek elkülönítésére a találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, hogy a mikroorganizmus sejtjeinek eltávolítására szüljük a tenyészetet, a szűrletet töményítjük, majd további töményítés céljából egy szerves oldószert, például acetont, etanolt, metanolt vagy izopropanolt adunk a töményített szűrlethez, amikor kicsapódnak az enzimek. A kicsapást végezhetjük egy kicsapószerrel, például ammóniumszulfáttal is. Abban az esetben, ha az enzim-kicsapást ammóniumszulfáttal végezzük, úgy járunk el, hogy az oldatot 70-75 %-osan telítjük ammóniumszulfáttal, amikor csapadék alakjában 60—100%-os (3-amiláz és a-1,6-glükozidáz keveréket kapunk. Mivel vagy az egyik, vagy mindkét enzim jól adszorbeálódik keményítőn, aktív szénen, különböző diatomaföldeken, például Celiten, Hyflo-Supercelen vagy Perliten, különböző agyagokon, például bentoniton, savas agyagon, Füllemarde-on, Kaolinon vagy talkumon, továbbá például kalciumfoszfáton, az enzimek ilyen adszorbensek segítségével elkülöníthetők. így például, a /3-amiláz jól adszorbeálódik keményítőn, különösen előzőleg 40 C° és 65 C° közötti hőmérsékleten kezelt keményítőn. Ha kukoricakeményítőt adunk a tenyészléhez, úgy 1 g, 40 C° és 65 C° közötti hőmérsékleten előkezelt keményítőn 3000 8000 egység (3-amiláz adszorbeálódik (lásd a 2. táblázatot). 2. táblázat Hőmérséklete (C°) A keményítő előkezelés ideje (perc) Egy g keményítőn adszorbeálódó ßamiláz (egység) 40 10 3010 50 10 5930 55 10 6890 60 10 7650 65 10 8130 80 10 (zselatinizálódik) 7890 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
