173275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ß-amiláz és Ó-1,6-glükozidáz előállítására
3 173275 4 Ezideig mindkét enzim előállítása két különböző mikroorganizmusnak egymástól elkülönített tenyésztésére volt szükség. Emellett a két enzim pH- és hőmérsékletigényének különbözősége miatt nehézségeket okozott az enzimek keményítővel való reakciójának kivitelezése egyazon időben. A maltózt mindezideig két lépésből álló eljárás segítségével állították elő, amelynek során először az ú-l,6-glükozidázt reagáltatták a keményítővel, majd a keletkezett egyenesláncú, amilózszerű terméket a /3-amilázzal maltózzá hidrolizálták. A találmány szerinti eljárás szerint úgy járunk el, hogy egy Bacillus nembe tartozó, egyazon időben j3-amüáz és a-1,6-glükozidáz termelésére képes mikroorganizmust az enzim szintézisét lehetővé tevő körülmények között tenyésztünk, és a tenyészléből elkülönítjük a j3-amilázt és az a—1,6-glükozidázt. Vizsgálataink során három törzset találtunk, amelyek egyazon időben mind 0-amilázt, mind a—1,6-glükozidázt is termelnek. Az 1. ábrán megadjuk a Bacillus cereus var. mycoides által termelt (i-amiláz és az a— 1,6-glükozidáz aktivitásának pH-függését. A 2. ábrán bemutatjuk a két enzim aktivitásának változását a hőmérséklet függvényében. A 3. ábrán bemutatjuk a két enzim állandóságát különböző pH-értékeken. A 4. ábrán a két enzim hőstabilitását adjuk meg. Az 5. ábrán bemutatjuk a reakcióidő és a hidrolízis mértékének (maltóz-keletkezés) összefüggését azokban az esetekben, amikor a megadott mikroorganizmus tenyészlevét amillózzal, amilopektinnel, burgonyakeményítővel, glikogénnel és dextrinnel reagáltattuk. Szem előtt tartva azt a feltevést, hogy ha a ß-amilazt és az a-1,6-glükozidázt egyszerre egy időben állíthatnánk elő, majd elkülönítve ezeket, egy enzimkészítmény alakjában használhatnánk, mint egy igen előnyös enzimet, a maltóz előállítására, számtalan mikroorganizmust megvizsgáltunk azon célból, vajon van-e közöttük olyan, amely (3-amilázt és a-1,6-glükozidázt is termel? Három törzset találtunk, amelyek egyazon időben mind 0-amilázt, mind a-1,6-glükozidázt is termelnek. Mindhárom törzs a Bacillus nembe tartozó baktériumnak bizonyult, Bacillus cereus var. mycoides-nek, Bacillus sp. YT 1002-nek és Bacillus sp. YT 1003-nak neveztük el őket. A találmány szerinti eljárás során használt baktériumokon kívül ezideig nem ismeretesek olyan mikroorganizmusok, amelyek egyazon időben mind a 0-amiláz. mind az a-1,6-glükozidáz termelésére képesek volnának. A Bacillus cereus var. mycoides nevű mikroorganizmust 1973. december 20-án FERM No. 2391 sorszámmal letétbe helyeztük a japán Fermentation Research Institute of Chiba-shi törzsgyűjteményben, míg a Bacillus sp. YT 1002 és Bacillus sp. YT 1003 jelű mikroorganizmusokat ugyanazon intézetben FERM No. 2837 és FERM No. 2838 sorszám alatt 1973. december 12-én helyeztük letétbe. A továbbiakban megadjuk a mikroorganizmusok mikológiái tulajdonságait. Bacillus cereus ver. mycoides (Ferm No. 2391): Pálcika-alakú, mérete 1,1 — 1,4 ju és 4,2 — 7,0 p közé esik, általában rövid-hosszú, a gombáknál vagy Actinomyces-eknél előforduló láncokban áll. Nem mozog. Gram-pozitív festődésű, sporangiák, nem felbecsülje tőén duzzadt. Tápleves: jó növekedés, ülepedik. Tápagar: igen jó növekedés, hosszú filamentek, szétszóródó, krémfehér színű. Glükóz-aszparagin agar: nincs jó növekedés, filamentek, Glükóz-nitrát-agar: nincs növekedés vagy elvétve látszanak telepek. Tirozin-agar: jó növekedés, filamentek, enyhén barna színű. Citrát-hasznosítás: pozitív. Tej: peptonizáció. Burgonya: jó növekedés, színe krémfehér vagy enyhén barna. Zselatin: elfolyósítás figyelhető meg. Ammónia-termelés: pozitív. Acetil-metilkarbinol-termelés: pozitív. Nitrát-redukció : pozitív. Kataláz-aktivitás: pozitív. Indol-termelés: negatív. Keményítő-hidrolízis: pozitív. NaCl-leves: 4 % NaCl jelenlétében nincs növekedés. Bacillus sp. YT 1002 (FERM No. 2837): Pálcika alakú, mérete 1 - 1,2 ju és 5-6p; nem mozgó, Gram-pozitív festődésű: általában rövid-hosszú láncokban fordul elő. Tápleves: ülepedik Tápagar: jó növekedés, elszórtan fejlődik. Glükóz-aszparagin-agar: elvétve látható növekedés. Glükóz-nitrát-agar: elvétve látható növekedés. Tej:enyhe peptonizáció. Burgonya: jó növekedés, elszórt, színe krémfehér. Zselatin: elfolyósítja. Ammónia-termel és: pozitív. Nitrát-redukció: pozitív. Kataláz-aktivitás: pozitív. Acetil-metilkarbinol-termelés: pozitív. Citrát-agar: elvétve látszik növekedés. Szerves nitrogénforrás: igényli a növekedéséhez. Szénhidrát: glükózból, fruktózból, galaktózból, mannózból, laktózból, maltózból, trehalózból, szorbitból, glicerinből, keményítőből és glikogénből savat igen, gázt nem termel. Hőmérsékletigénye a növekedés szempontjából: 50 C° hőmérsékletileg nő. Optimális növekedés: 30-35C0 hőmérsékleten. Izolálás helye : földminta Bacillus sp. YT 1003 (FERM No. 2838): Pálcika alakú, mérete 1 — l,6ju és 2—7p között változik. Általában rövidebb-hosszabb láncokban fordul elő; nem mozog: Gram-pozitív festődésű. Tápleves: jó növekedés, ülepedik. Tápagar: jó növekedés, elszórt, krémfehér színű. Glükóz-aszparagin-agar: ritka növekedés. Tej : peptonizálás látszik, koaguláció nem. Zselatin: enyhén folyósítja. Ammónia-termelés: pozitív. Nitrát-redukció: pozitív. Kataláz-aktivitás: pozitív. Acetil-metilkarbonil-termelés : pozitív. Citrát-hasznosítás: pozitív, mint szénforrást. Szénhidrát: a glükózt, fruktózt, galaktózt, mannózt, L-arabinózt, D-xilézt, szacharózt, laktózt, maltózt, trehalózt, raffinózt, mannitot, szorbitot, glicerint és inulint gázkeletkezés nélkül hasznosítja. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
