173215. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin, inzulin-analógok és inzulin- származékok előállítására
13 173215 14 helyett) = a lia általános képletű_ csoport körébe tartozó Ild képletű csoport, X=—SO3 , Y= hidrogén - atom. A terméket az 1. példa szerint tisztítjuk, redukáljuk és III általános képletű inzulin NaAlN€ B29-<z,a -diamino-dikarbonsav-származékká dehidrogénezzük. A maradékot feloldjuk 50 ml 10%-os ecetsav-oldatban majd négyszer 100 cm-es Sephadex G 75 „finom” oszlopon kromatografáliuk. Az oszlop III általános képletű inzulin-NaA'NeB29-a,a-diamino-dikarbonsav-származékkal kalibrált. Az oszlopon egy „előcsúcs” (0,3 g) után megjelenik a III általános képletű „inzulin-csúcs” (3,5 g). Az „előcsúcs” anyagát az 1. példa szerint redukáljuk és 1,5 liter vízben - a fentiek szerint - oxidáljuk. Akromatografálás után kapott 3,5 g III általános képletű inzulin-N“A1N e B 2 9a,adiamino-dikarbonsav-származékot az 1. példa szerint Edman-féle lebontásnak vetjük alá. 2,0 g nyers des-Phe®1-marha-inzulin-t kapunk. Sephadex G 75-ös — a fentiek szerint végzett — kromatográfiás tisztítás után olyan inzulin frakciót kapunk, amelyből az inzulint a szokásos módon cinkklorid hozzáadásával és a pH 5,4-re állításával amorf alakban leválasztjuk. A termék 1-2 napon belül kristályosodik. Óvatosan lecentrifugáljuk a ki nem kristályosodott részről, megismételjük a kristályosítást és így 1,4b g des-Phe®1-inzulint (marha) kapunk (20% az alkalmazott A-láncra vonatkoztatva), amelynek biológiai hatékonysága 23—241. E./mg. 4. példa Bl-acetil-inzulin (sertés) a) A-lánc-S-tetraszulfonát (sertés) Az előállítást az la) példával analóg módon végezzük, a sertés-inzulin-A-Iánc aminosav-szekvenciája szerint. A szintézis kitermelése: 68%, a szulfitolízisé: 32%. b) Bl-acetil-B-lánc-S-diszulfonát A lánc szintézise az lb) példával analóg módon történik, azzal a különbséggel, hogy Lys-t Boc-Lys-Z(Cl)-0 Np alakjában és Phe -t N-acetil-Phe-ONp alakjában alkalmazzuk. A szintézis befejezése után ismert módon fluorhidrogénsawal lehasítjuk a gyantáról a B-láncot. Kitermelés: 59% az első aminosavra AlaB30-ra vonatkoztatva. A diszulfonáttá történő alakítást az la) példával analóg módon végezzük.-diamino-parafasav-mono-2,4,5-triklórfenil-észtermono-A-lánc-tetraszulfonátját (kitermelés 2,65 g). Ezt újból feloldjuk 3Ö0 ml dimetilszulfoxidban, hozzáadunk 3,0 g 4b) példa szerint előállított N-ace- 5 til-B-lánc-diszulfonátot, 120 mg 1-hidroxi-benzotriazolt és kevés trietilamint (pH 9-ig), és a reakcióelegyet 6 órán keresztül keverjük szobahőmérsékleten. Ezután leválasztjuk a terméket 10:1 arányú éter-metanol-eleggyel. Kitermelés: 5,38 g. 10 A nyers reakció terméket feloldjuk 40 ml trifluorecetsavban és 40 perc múlva leválasztjuk 400 ml 'éterrel az I általános képletű vegyületet, ahol R1 (R helyett) = a Ha általános képletű csoportok körébe tartozó He képletű csoport, X=— SO3 és Y=acetil-cso- 15 port. (Kitermelés: 5,06 g). A terméket az 1. példa szerint tisztítjuk, redukáljuk és III általános képletű inzulin-NaA'NeB29-a,a-diamino-dikarbonsav-származékká dehidrogénezzük. A maradékot feloldjuk 50 ml 10%-os ecetsav-oldat- 20 ban, majd négyszer 100 cm-es Sephadex G 75 „finom” oszlopon kromatografáljuk [vagy megoszlási kromatográfiát alkalmazunk Sephadex LH 2Q-on(lásd az ld) példát) ]. Az oszlop III általános képletű i nz u 1 i n-N“ A * N e B 2 9 -a.a-diamino-dikarbonsav-szár- 25 mazékkal kalibrált; oszlopon egy „előcsúcs” (0,55 g) után megjelenik az „inzulin-csúcs” (3,75 g). Az „előcsúcs” anyagát az 1. példa szerint redukáljuk és a fentiek szerint - oxidáljuk. A kromatografálás után kapott 3,75 g III általános 30 képletű inzulin-NaA1NeB29-a,a-diamino-dikarbonsav-származékot az 1. példa szerint Edman-féle lebontásnak vetjük alá. 2,6 g nyers Bl-acetü-inzulint kapunk, (sertés) Sephadex G 75 vagy G 50 „szuperfinom” - a fentiek szerint végzett - kromatográfiás 35 tisztítás után olyan inzulin-frakciót kapunk, amelyből a Bl-acetil-inzulint, a szokásos módon cinkklorid hozzáadásával éa a pH 5,4-re állításával amorf alakban leválasztjuk. A termék 1-2 napon belül kristályosodik. Óvatosan lecentrifugáljuk a ki-nem-kristályoso- 40 dott részről, megismételjük a kristályosítást és így 1,65 g (27%) (az alkalmazott A-láncra vonatkoztatva) terméket kapunk, amelynek biológiai hatékonysága 22-241. E./mg. 45 5. példa Humán-inzulin 50 a) A-lánc-S-tetraszulfonát (humán) Az előállítást az la) és 4a) példákkal analóg módon végezzük. A szintézis kitermelése: 55%, a szulfitolízisé 33%. c) Bl-acetil-inzulin (sertés) 2,8 g 4a) példa szerint készített A-lánc-tetraszulfonátot feloldunk 300 ml dimetilszulfoxidban, N-etil- 60 morfolin hozzáadása közben, az oldatot 9-es pH-ra állítjuk be és hozzákeverünk 1,65 g lc5. példa szerint előállított di-Boc-2,7-diaminoparafasav-bisz-2,4,5-tri- Idórfenil-észtert. 20 óra elteltével 10:1 arányú éter-metanol-elegy segítségével leválasztjuk a di-Boc-2,7- 65 b) N^-Boc-Ala-B-lánc-S-diszuifonát (humán) A szintézist az lb) példával analóg módon végezzük. Első aminosavként azonban a gyanta hidroxilcsoportjaival észterezett Boc-Thr-OH-t alkalmazunk. Kitermelés: 62%. Befejezett szintézis után a B-láncot ismert módon íluorhidrogénsawal lehasítjuk a gyantáról. Kitermelés: 58%, az első aminsavra ThrB -ra vonatkoztatva. 7
