173215. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin, inzulin-analógok és inzulin- származékok előállítására
15 173215 16 3,6 g (1 millimól) még S-védett NeB29-Pht-B-láncot feloldunk 100 ml dimetilszulfoxidban és egy óra leforgása alatt szobahőmérsékleten 390 mg (1,2 millimól) Boc-Ala-ONp-vel reagáltatjuk, 135 ml 1-hídroxibenzotriazol jelenlétében. Az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, míg 10 ml térfogatnyi reakcióelegy marad vissza, majd etilacetátot adunk hozzá, és így 3,5 g Boc-Ala-S-terc-butilmerkapto-Ne-Pht-B-láncot kapunk. A ftaloil'csoport lehasítása végett a vegyületet feloldjuk 100 ml 80%-os fenolban, és 4 ml hidrazinhidrát hozzáadása után a reakcióelegyet 16 órán keresztül 40 °C-on melegítjük. Ezután leválasztjuk a ftaloil-csoporttól mentes vegyületet 1 liter izopropanol-éter-elegy (1 + 5) segítségével. 3,3 g terméket kapunk. A diszulfonáttá alakítást az la) példával analóg módon végezzük. Kitermelés: 3,0 g. Mint ahogy az 1 b) példánál láttuk, Alá helyett a B-lánc-S-diszulfonát Gly-t is tartalmazhat. c) Humán-inzulin 2,8 g 5a) példa szerint készített A-lánc-tetraszulfonátot feloldunk 300 ml dimetilszulfoxidban, N-etilmorfolin hozzáadása közben az oldatot 9-es pH-ra állítjuk be és hozzákeverünk 1,55 g lc6. példa szerint előállított di-Boc-2,8-diamino-azelainsav-bisz-2,4,5-triklórfenil-észtert. 20 óra elteltével 10:1 arányú étermetanol-elegy segítségével leválasztjuk a di-Boc-2,8- -diamino-azelainsav-mono-2,4,5-triklórfenil-észter mono-A-lánc-tetraszulfonátját (kitermelés: 2,63 g). Ezt újból feloldjuk 300 ml dimetilszulfoxidban, hozzáadunk 3,0 g lb) példa szerint előállított N“-Boc-Ala-B-lánc-diszulfonátot, 120 mg 1-hidroxi-benzotriazolt és kevés trietilamint (pH 9-ig), és a reakcióelegyet 6 órán keresztül keverjük szobahőmérsékleten. Ezután leválasztjuk a terméket 10:1 arányú éter-metanoleleggyel. Kitermelés: 5,52 g. A nyers reakcióterméket felvesszük 40 ml trifluorecetsavban és 40 perc múlva leválasztjuk 400 ml éterrel az 5,04 g I általános képletű vegyületet, ahol R’ (R helyett)= a Ha általános képletű csoportok körébe tartozó Ilf képletű csoport, X-—SÖ3 és Y=Aia. A terméket az 1. példával analóg módon tisztítjuk és III általános képletű inzulin-NaA 1 NeB29-a,a-diamino-dikarbonsav-származékká dehidrogénezzük. A maradékot feloldjuk 50 ml 10%-os ecetsav-oldatban, majd négyszer"ÎQ0 cm-es Sephdex G 50 „szuperfinom” oszlopon kromatografáljuk, [vagy megoszlási kromatográfiai alkalmazunk Sephadex LH 20-on az 1. példa szerint]. Az oszlop III általános képletű inzulin-Na A 1N e B29-a,a-diamino-dikarbonsav-származékkal kalibrált. Az oszlopon egy „előcsúcs” (0,57 g) után megjelenik az „inzulin-csúcs” (3,68 g). Az „előcsúcs” anyagát az 1. példa szerint redukáljuk és — a fentiek szerint oxidáljuk. A kromatografálás után kapott 3,68 g nyers III általános képletű irzulin-származékot az 1. példa szerint Edman-féle lebontásnak vetjük alá. 3,1 g nyers humán-inzulint kapunk, újbóli Sephadex G 75-ös — a fentek szerint végzett - kromatográfiai tisztítás után olyan inzulin-frakciót kapunk, amelyből az inzulint a szokásos módon cinkklorid hozzáadásával és a pH 5,4-re állításával amorf alakban leválasztjuk. A termék 1—2 napon belül kristályosodik. Óvatosan lecentrifugáljuk a ki-nem-kristályosodott részről, megismételjük a kristályosítást és így 2,11 g (35,7%) (az alkalmazott A-láncra vonatkoztatva) terméket kapunk, melynek biológiai hatékonysága 24-25 I. E./mg. 6. példa Des-PheB 1 -inzulin (marha) A cím szerinti termék előállítását marha-inzulinból szulfitolízissel végezzük ismert módon, (la) példa) b) Nb 1 -trifluoracetil-B-lánc-diszulfonát (marha) A cím szerinti termék előállítását NB1 -trifluoracetil-inzulinból (marha) az 1 b) példával analóg módon végezzük. A kiindulási anyagot a következőképpen nyerjük: NaA!,-NeB29-bisz-Boc-inzuIint [előállítása Hoppe Seyler Z. Physiol. Che. 352. 1487 (1971) cikk szerint] feloldjuk dimetilformamidban, és körülbelül 5 mólekvivalensnyi trifluorecetsav-metilészterrel reagáltatiuk. A kapott termék NaA1, N®29-bisz-Boc-N°B -trifluoracetil-inzulin (marha). 45 perces trífluorecetsavas kezeléssel lehasítjuk a Boc-csoportokat, majd a kapott terméket megoszlási kromatográfia segítségével Sephadex LH 20-en n-butanol-jégecet-víz 2:1:10 arányú elegyével tisztítjuk. c) Des-PheB 1 -inzulin (marha) 2,8 g 6a) példa szerint készített A-lánc-tetraszulfonátot feloldunk 200 ml dimetilszulfoxidban, 1,11 ml N-etil-morfolin és 1,65 g di-Boc-2,7-diarninoparafasav-bisz-2,4,5-triklórfenil észter hozzáadása és keverés közben. 20 óra elteltével 10:1 arányú éter-metanolelegy segítségével leválasztjuk a di-Boc-2,7-diaminoparafasav-mono-2,4,5-triklórfenil észter mono-A-lánc-tetraszulfonátját. (Kitermelés: 3,5 g). Ezt újból feloldjuk 200 ml dimetilszulfoxidban, hozzáadunk 3,45 g 6b) példa szerint előállított NB1-trifluoracetil-B-lánc-díszulfonátot, 130 mg 1-hidroxi-benzotriazolt és 1,1 ml N-etilmorfolint, és a reakcióelegyet 6—24 órán keresztül keverjük szobahőmérsékleten. Ezután leválasztjuk a terméket 10:1 arányú éter-metanoleleggyel. (Kitermelés: 5,4 g). A nyers reakcióterméket feloldjuk 40 ml trifluorecetsavban és 40 perc múlva leválasztjuk 0 °C-on 400 ml éterrel az I általános képletű vegyületet, ahol R’ (R helyett) = a Ha általános képletű csoportok körébe tartozó He képletű csoport, X = —SO3 és Y = CF3CO-csoport. (Kitermelés: 5,0 g). A terméket feloldjuk 0,05 mólos ammóniumhidrogénkarbonát-oldatban (pH=8,5) és Sephadex G 50 „szuperfinom” oszlopon kromatografáljuk (kitermelés liofilizálás után 4,5 g), és az 1. példával analóg módon redukáljuk és 9-es pH-nál több mint 150 órán keresztül oxidáljuk. Ilyen körülmények között egyúttal lehasad a trifluoracetil-csoport is. Ecetsavval beállítjuk a pH-t 5,5-re és az anyagot liofilizáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
