173215. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin, inzulin-analógok és inzulin- származékok előállítására
173215 12 11 hidrát hozzáadása után 16 órán keresztül 40 °C-on melegítjük a reakcióelegyet. Ezután leválasztjuk a ftaloil-csoporttól mentes vegyületet 1 liter izopropanol-éter-elegy (1+5) segítségével. 3,3 g ftaloil-csopor' mentes terméket kapunk. A diszulfonáttá alakítást az 5 la/ példával analóg módon végezzük. Kitermelés: 3,1 g-c) Des-(Phe-Vai)B 1 ~~2-des-AiaB3°- 10 [AlaA1 ,l 4,18,21 ]-inzulin (sertés) 2,8 g a) pont szerint készített A-lánc-tetraszulfonátot feloldunk 100 ml dimetilszulfoxidban, N-etilmorfolin hozzáadása közben, az oldatot 7,5-ös pH-ra 15 állítjuk be és hozzákeverünk 2 g 1 .C-2 példa szerint előállított nitrofenil-észtert. 20 óra elteltével 10:1 arányú éter-metanol-elegy segítségével leválasztjuk a kapott di-Boc-L-lantionin-mono-nitrofeníl-észter mono-A-lánc-tetraszulfonátját. Kitermelés: 2,4 g 20 (80%). Ezt újból feloldjuk 100 ml dimetilszulfoxidban, hozzáadunk 2,9 g 2b/ példa szerint előállított B-lánc-diszulfonátot, 120 mg 1-hidroxi-benzotriazolt és kevés trietilamint (pH 9-ig), és a reakcióelegyet 1 órán keresztül keverjük szobahőmérsékleten. Ezután 25 leválasztjuk a terméket 10:1 arányú éter-metanol-eleggyel. Kitermelés: 5,0 g. A nyers reakcióterméket feloldjuk 40 ml trifluorecetsavban és 40 perc múlva leválasztjuk 400 ml éterrel. 4,9 g I általános képletű vegyületet kapunk, 30 ahol R’ (R helyett) = a Ila általános képletű csoportok körébe tartozó IIc képletű csoport, X = — S03 , Y = hidrogénatom és a B lánc B1 és B30-al rövidített. A terméket feloldjuk, 0,25 liter 8,6-os pH-jú vízben. Az oldathoz 50 ml tioglikolt adunk, 6 órán 35 keresztül nitrogénáram alatt tartjuk, a terméket leválasztjuk a 15-szörös mennyiségű ecetsavas acetonnal, majd centrifugáljuk és ecetsavas acetonnal mossuk. Ezután feloldjuk az anyagot kevés mennyiségű 1 n ammóniumhidroxíd-oldatban, 25 literre hígítjuk és 1 40 n ammóniumhidroxid-oldat segítségével a pH-t 10-re állítjuk be, 30 órán kérésziül keverjük enyhe levegőáramoltatás közben 10 °C-on, majd ecetsawal a pH-t 5,5-re állítjuk be és a kapott reakcióelegyet liofilizáljuk. 45 A maradékot feloldjuk 50 ml 10%-os ecetsav-oldatban majd négyszer 100 cm-es Sephadex G 75 „finom” oszlopon kromatografáljuk. Az oszlop Ili általános képletű inzulin-NaA^NeB29-a,a-diamino-dikarbonsav-származékokkal kalibrált. Az oszlopon egy „előcsúcs” (0,4 g) után megjelenik a fentiekben megadott III általános képletű úgynevezett „inzulincsúcs” (3,0 g). Az „előcsúcs” anyagát az 1. példa szerint redukáljuk és 1,5 liter vízben — a fentiek szerint — 10,0-es pH-n oxidáljuk. 50 55 A kromatografálás után kapott 3,0 g III általános képletű inzulin-NaA1NeB29- a^t-diamino-dikarbonsav-származékot szárítás után az 1. példa szerinti 60 Edman-féle lebontásnak vetjük alá. Sephadex G 75-ös kromatogiáfiás tisztítás után cím szerinti inzulin-frakciót kapunk (1,4 b; 17%) (az alkalmazott A-láncra vonatkoztatva (amelynek biológiai hatékonysági körülbelül 20 I E./mg. 65 6 Des-Phe-81 -inzulin (marha) a) A-lánc-S-tetraszulfonát (marha) A cím szerinti vegyületet a Z. Naturforschung 24b, 1127-1139 (1969) cikkel analóg módon, de a Hoppe Seyler [Z. Physiol Chem, 352, 2 (1971)] javításokat alkalmazva állítjuk elő. A védőcsoportok lehasítását, az S-tritil-csoportokét is úgy végezzük, hogy feloldjuk a pétidét trifluorecetsavban, majd 1 óra múlva beleöntjük vízbe. Szűrés és éteres extrahálás után az éteres extraktumot liofilizáljuk és a kapott anyagot a Z. Naturforschung 24b, 1138 (1969) cikkben leírtakkal analóg módon a cím szerinti S-tetraszulfonáttá alakítjuk. 3. példa b) Na-Boc-B-lánc-S-diszulfonát (marha) A B-láncot az lb/ példával analóg módon szintetizáljuk. Befejezett szintézis után a B-láncot ismert módon fluorhidrogénsawal lehasítjuk a gyantáról. Kitermelés: 55%, az első aminosavra AlaB -ra vonatkoztatva. 3,6 g (1 millimól) még S-védett Ne-Pht-B-láncot feloldunk 100 ml dimetilformamidban és 1 óra leforgása alatt szobahőmérsékleten 300 mg (1,2 millimól) Boc-ONp-vel reagáltatjuk, 135 mg 1-hidroxi-benzotriazol jelenlétében. Az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, míg 10 ml térfogatnyi reakcióelegy marad vissza, maid hozzáadunk etilacetátot és így kapunk 3,5 g br-Boc-S-terc-butilmerkapto-Ne-Pht-B-láncot. A ftaloil-csoport lehasítása végett a vegyületet feloldjuk 100 ml 80%-os fenolban, és 4 ml hidrazinhidrát hozzáadása után 16 órán keresztül 40 °C-on melegítjük a reakcióelegyet. Ezután leválasztjuk a ftaloil-csoporttól mentes vegyületet 1 liter izopropanol-éter-elegy (1+5) segítségével, 3,3 g terméket kapunk. A diszulfonáttá alakítást az la/példával analóg módon végezzük. Kitermelés: 3,0 g. c) Des-PheBl -inzulin (marha) 2,8 g 3a/ példa szerint készített A-lánc-tetraszulfonátot feloldunk 200 ml dimetilszulfoxidban, N-etilmorfolin hozzáadása közben, az oldatot 7,5-ös pH-ra állítjuk be és hozzákeverünk 2 g lc.4./ példa szerint előállított nitrofenil-észtert. 20 óra elteltével 10:1 arányú éter-metanol-elegy segítségével leválasztjuk a di-Boc-a,e-diamino - -mezo-pimelin-sav-mononitrofenil-észter mono-A-lánc-tetraszulfonátját. (Kitermelés: 2,65 g). Ezt újból feloldjuk 100 ml dimetilszulfoxidban, hozzáadunk 3.0 g 3b/ példa szerint előállított Na-Boc-B-lánc-diszulfonátot, 120 mg 1-hidroxibenzotriazolt és kevés trietilamint (pH 9-ig), és a reakcióelegyet egy órán keresztül keverjük szobahőmérsékleten. Ezután leválasztjuk a terméket etilacetáttal. Kitermelés: 5,5 g. A nyers reakcióterméket feloldjuk 40 ml trifluorecetsavban és 40 perc múlva 400 ml éterrel leválasztunk 5,0 g I általános képletű vegyületet, ahol R’ (R
