173215. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin, inzulin-analógok és inzulin- származékok előállítására
9 173215 d) Marha—inzulin 2,8 g la/ példa szerint készített A-lánc-tetraszulfonátot feloldunk 100—300 ml dimetilszulfoxidban, N-etilmorfolin hozzáadása közben, az oldatot 9-es pH-ra állítjuk be és hozzákeverünk 2,0 g l.C.5. példa szerinti előállított triklórfenil-észtert. 20 óra elteltével 10:1 arányú éter-metanol-elegy segítségével leválasztjuk a di-Boc-2,7-diaminoparafasav-mono-2,4,5-triklórfenil-észter mono-A-lánc-tetraszulfonátját. Kitermelés: 2,7 g (89%). Ezt újból feloldjuk 100-300 ml dimetil szulfoxidban, hozzáadunk 3,0 g lb/ példa szerint előállított N“-Boc-Aía illetve Na-Boc-Gly)-B-lánc-diszulfcnátot, 120 mg 1-hidroxi-benzotriazolt és kevés trietilamint (pH 9-ig), és a reakcióelegyet 6 órán keresztül keverjük szobahőmérsékleten. Ezután leválasztjuk a terméket 10:1 arányú éter-metanol-eleggyel. Kitermelés: 5,5 g. A nyers reakcióterméket feloldjuk 40 ml trifluorecetsavban, 40 perc elmúltával leválasztunk 400 ml éterrel 5,0 g I általános képletű vegyületet [R’ (R helyett) =a II a általános képletű csoportok körébe eső He képletű csoport: W— (CH2)4~ X= -SO3 és Y= Alá vagy Gly]. Sephadex G 50-en (oszlop: hossza: 4 m, átmérője: 4 cm) kromatografáljuk-a 0,05 mólos ammóniumhidrogénkarbonát-pufferoldatban pH=8,5—9-en oldott anyagot, majd liofízáljuk, és a kapott 3,3 g terméket feloldjuk 0,25 liter pH=8,6-os vízben. Az oldathoz 50 ml tioglikolt adunk, 6 órán keresztül nitrogénáram alatt tartjuk, a terméket 10-20-szoros mennyiségű ecetsavas acetonnal leválasztjuk, majd centrifugáljuk és ecetsavas acetonnal tioglikol-mentesre mossuk. Ezután kevés mennyiségű 1 n ammóniumhidroxidoldatban feloldjuk, 25 literre hígítjuk és 1 n ammóniumhidroxidoldat segítségével a pH-t 9-re állítjuk be, körülbelül 100 órán keresztül keverjük szobahőmérsékleten, enyhe levegőátáramoltatás közben, majd ecetsavval a pH-t körülbelül 4-5-re állítjuk be és a kapott reakcióelegyet liofilizáljuk. Az így kapott anyagot feloldjuk 50 ml ecetsavvagy hangyasav-oldatban, majd négyszer 200 cm-es Sephadex G 50 vagy G 75 „finom” oszlopon kromatografáljuk. [Megoszlási kromatográfiát is végezhetünk Sephadex LH—20-on n-butanol-ecetsav-víz 2:1:10 arányú elegyével (oszlop négyszer 100—négyszer 200 cm), és így is megfelelő tisztítást érünk el]. Az oszlop III általános képletű inzulin-NaA1 NB29-a,a-diamino-dikarbonsav származékkal kalibrált. Az oszlopon egy „előcsúcs” (0,3 g) után jelenik meg a fent ismertetett III általános képletű „inzulincsúcs” (2,5 g). Az „előcsúcs” anyagát a J. Am. Chem. Soc. 93, 3080 (1971) szerint 1,4-ditiotreitol folyékony ammóniás oldatával vagy tributilfoszfin híg ammóniumhidroxidos oldatával 8—10-es pH-n redukáljuk és 1,5 liter vízben — a fentiek szerint — 9-es pH-n oxidáljuk. A kromatografálás után kapott 2,5 g III általános képletű inzulin-NaAIN B29-a,a-díamino-dikarbonsavszármazékot 60 ml 95%-os piridinben kétszer egy óra hosszat keverjük 0,7 ml fenümustárolajjal 40 °C-on. A piridint 10 ml-re bepároljuk és éter hozzáadásával leválasztunk 2,4 g feniltiokarbomil-vegyületet. Szárítás után 2 órán keresztül 20 ml trifluorecetsavban hagyjuk állni 25 °C-on. 200 ml éter segítségével leválasztunk 2,2 g nyers inzulint, Újbóli — a fentiek szerint végzett - Sephadex G 75-ös kromatográfiás tisztítás után olyan inzulin-frakciót kapunk, amelyhez a szokásos módon cinkkloridot adva és a pH- t 5,4-re állítva, az inzulun amorf módon válik ki, de 1—2 napon belül kristályosodik. Óvatosan lecentrifugáljuk a nem-kristályos részről, megismételjük a kristályosítást és így 1,15 g (19%) (az alkalmazott A-láncra vonatkoztatva) inzulint kapunk, amelynek biológiai hatékonysága 23-24 I. E./mg. 10 2. példa Des-(Phe—Val)B 1 ~ 2-des-AlaB 3 °-[ AlaA 12. Ai4,is,2i j. -inzulin (sertés) a) [Alá12,14,18,21 ]-inzulin-A-lánc-S- -tetraszulfonát (sertés) Az la) példa szerint a szilárd-test-módszerrel előállítjuk a sertés-inzulin-A-lánc-S-tetraszulfonátot amikor is első aminosavként (A21) a Boc-Ala-OH-t észterezzük a gyanta hidroxil-csoportjaival, és a 18, 14 és 12 helyzetekbe bevisszük a Boc-Ala-ONp-t a természetes láncban levő aminosavak helyett. A további szintézismenet és feldolgozás az la) példát követi. A szintézis kitermelése: 69%, a szuifholízis kitermelése: 34%. b) Na-Boc-des-PheB 1 -des-Ala® 3°-inzulin-B-lánc-S-diszulfonát (sertés) A marha-inzulin-B-láncot Hoppe Seyler Z. Physiol. Chem. 348, 1355 (1967) és 352, 419 (1971) cikkekben leírt, valamint Merrifield: Biochemistry 3, 1385 (1964) cikkében leírtak szerint állítjuk elő, kiindulva 1% divinilbenzollal térhálósított polisztrirolgyantából. Lizint Boc—Lys(Pht)-ONp alakjában alkalmazzunk, minden további aminosavat ugyancsak Boc-nitrofenil-észterré alakítjuk, az oldalláncokon levő további karboxü-csoportokat - Merrifield előírásaival analóg módon — benzil-észterré és a szerin és tirozin hidroxil-csoportjait benzil-éterré alakítjuk. A cisztein szulfhidril-csoportját az S-terc-butilmerkapto-csoporttal védjük (Peptides 1969, North Holland Publishing Com., Amsterdam 1971,30 oldal.) Minden kondenzációs lépést 1 -hidroxi-benzotriazol jelenlétében végezzük. A szintézis befejezése után a B-láncot ismert módon fluorhidrogénsawal lehasítjuk a gyantáról. Kitermelés: 55%, az első aminosavra, az AlaB30-ra vonatkoztatva. 3,6 g (1 mülimól) még S-védett Ne-Pht-B-láncot feloldunk 100 ml dimetilszulfoxidban és egy óra leforgása alatt szobahőmérsékleten 300 mg (1,2 millimól) Boc-ONp-vel reagáltatjuk, 135 mg 1-hidroxi-benzotriazol jelenlétében. Az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, míg 10 ml térfogatnyi reakcióelegy marad vissza majd hozzáadunk etilacetátot és így kapiuk a megfelelő 3,5 g Boc-S-terc-butümerkapto-N f-Pht-B-láncot. A ftaloil-csoport lehasítása végett a vegyületet feloldjuk 100 ml 80%-os fenolban, és 4 ml hidrazin-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
