173215. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin, inzulin-analógok és inzulin- származékok előállítására
5 173215 6 éterrel vagy etilacetáttal kicsapjuk és igy kapjuk közbenső vegyületként például a VI képletű A-lánc-szulfonát-hídképző reagnes kondenzációs terméket. Ezt újból feloldjuk, előnyösen dimetilformamidban, foszforsav-dimetilamidban vagy dimetilszulfoxidban és hozzáadunk körülbelül ekvimoláris mennyiségű B-lánc-szulfonátot, a savas csoportok semlegesítéséhez elegendő mennyiségű N-etil-morfolin vagy trietilamin jelenlétében körülbelül 8-10 pH-nál, és körülbelül 1 mólekvivalensnyi 1-hidroxi-benzotriazolt. A hozzáadott B-lánc LysB2 9-ében az e-amirio-csoport szabad, a PheB1 a-amino-csoportja például egy Boc-csoporttal védve lehet. Egy ilyen lánc előállítását ismerteti az 1 b példa. Szobahőmérsékleten körülbelül 30 perc — 6 óra múlva reakciótermékként olyan nehezen oldódó I általános képletű vegyülethez jutunk, amelyben X jelentése szulfo-csoport (SO3), R jelentése pedig a II általános képletű csoportok körébe tartozó Hb képletű csoport és Y jelentése Boc-Ala, illetve Boc-Gly. A találmány szerinti eljárás értelmében a Boc-csoportokat 30—60 perces trifluorecetsavas kezeléssel lehasítjuk. A reakcióterméket éterrel leválasztjuk és a szárított anyagot, adott esetben kromatográfiás tisztítás után, feloldjuk 8 mólos karbamid-oldatban vagy 5—9 pH-jú vízben. Nitrogénáramban 0—60 °C-on 10-500-szoros feleslegben hozzáadunk tioglikolt vagy a számított mennyiségű trialkinfoszfin, például tributilfoszfin 1—5-szörösét és körülbelül 4—6 órás, szobahőmérsékleten végzett reakció befejeztével kicsapjuk a reakcióterméket ecetsavas acetonnal. A terméket centrifugáljuk és többször mossuk ecetsavas acetonnal. Ezután lehetőleg kevés vízzel ammóniában oldjuk és 0,05 mólos — 10—10,6-os pH-ra beállított ammóniumhidrogénkarbonát-oldattal hígítjuk 0,01—1 mg/ml peptidkoncentrációra és éjszakán át keverjük lassan levegőáramoltatás közben. Dolgozhatunk alacsonyabb pH-n is, például 8-10 közötti pH-n, de akkor hosszabb reakcióidőre van szükségünk, körülbelül 150 órára. A pH-t ezután beállítjuk 1 n ecetsav-oldat segítségével 4-5,5-re és/vagy liofizáljuk vagy vákuumban szárazra pároljuk a reakcióelegyet. Tisztítás céljából feloldjuk a terméket 1— 2 n ecetsav-oldatban és 1—2 m hosszú Sephadex G 50 vagy G 75 oszlopon kromatografáljuk. A körülbelül Sornyi úgynevezett „inzulincsúcs” anyagát a következőképpen dolgozzuk fel tovább: [a rosszul kapcsolódott terméket pedig (körülbelül 30%) redukció útján újbóli kapcsolásba visszük]. A kapott III általános képletű inzulin -NaAI N®2 9-a,a-diamino-dikarbonsav-származékot körülbelül 20-szoros mennyiségű 95%-os piridinben feloldjuk. Szűrés után 8-16 mólnyi fenillizotiocianáttal (fenilmustárolajjal) reagáltatjuk a reakcióelegyet. A reakciót körülbelül 10-30 rfC-on végezzük és körülbelül 1 óra hosszat tart. Az oldószert ezután részben vákuumban ledesztilláljuk és a terméket éterrel kicsapjuk. Ezi a műveletet megismételjük és a csapadékot körülbelül 2 óra hosszat kezeljük 5-10- szeres mennyiségű trifluorecetsawal, körülbelül 25 °C-on. A nyers inzulint éterrel leválasztjuk, feloldjuk 1—2 n ecetsav oldatban és 1-2 m hosszú Sephadex G 50 vagy G 75 oszlopon kromatografáljpk és a szokásos módon közvetlenül az oldatból, cink-ionok hozzáadásával, 5,4—5,5-ös pH-n leválasztjuk, illetve adott esetben kristályosítjuk. Kitermelés kristályos anyagból: 15-30%, (az adott esetben újból redukált, rosszul kapcsolódott anyagot ebbe nem számítottuk bele). A kristályosított, a találmány szerinti eljárással kapott inzulin biológiai hatékonyságát nyulak vércukor-csökkenésén méijük: 23 I. E./mg. Az aminosavanalízis helyes (korrekt) eredményt szolgáltat. A pankreaszból nyert termék helyett a találmány szerinti végterméket alkalmazhatjuk a Diabetes mellitus kezelésére. Az A- és B-láncoknak az itt következő példákban leírt szilárd-test-módszerrel végzett szintézise elvégezhető az ismert fragmens-kondenzálási módszerrel is, például a karboiimind-eljárással, adott esetben N-hidroxi-szukcinimid, 1-hidroxi-benzotriazolok, 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-l ,2,3-benzotriazin hozzáadásával, vagy az azid-eljárással, amelyekkel előállítjuk a kiindulási anyagként az egyes esetekben szükséges A- és B-láncokat. Az I általános képletű vegyületek is helyetes (korrekt) aminosav-analízist eredményeznek. A vegyület az elektroforézis során az anódhoz vándorol és biológiailag aktív. A III általános képletű inzulin-NaA1N ® 2 9a.a -diamino-dikarbonsav-származékok is helyes (korrekt) aminosav-analízist eredményeznek. A vegyületek az elektroforézis során a katódhoz vándorolnak és biológiai aktivitásuk mintegy 30%. 1. példa Marha-inzulin a) A-lánc-S-tetraszulfonát (marha) A marha-inzulin-ATáncot Hoppe Seyler Z. Physiol. Chem. 352, 419-429 (1971) cikkben leírt szilárdtest-módszerrel állítjuk elő, kiindulva 1% divinilbenzollal térhálósított polisztriolgyantákból. Az első aminosavat, az aszparagint, Boc—Asn (MBH) -OH alakban — [amelyet H-Asn (Mbh) -OH [Chem. Bér. 103, 2041-2051 (1970)] és Boc-azid reakciójával készítettünk] a gyanta hidroxil-csoportjaival ismert módon észterezzük. Minden további aminosavat Boc-aminosav-4-nitrofenil-észter alakjában használunk fel. Az oldalláncon levő karboxil-csoportokat benzil-észterré és a trozin hidroxil-csoportjait benzil-éterré alakítjuk. A cisztein szulfhidril (HS)-csoportját az S-terc-butilmerkapto-csopçrttal védjük [Peptides 1969, North Holland Publishing Comp., Amsterdam 1971.30 old ] Minden kondenzációs lépést 1-hidroxi-benzotriazol jelenlétében a „Chemistry and Biology of Peptides” (1972) könyv 343. oldalán leírtakkal analóg módon végzünk, hogy növeljük a reakciósebességet és a szabad amino-csoportok peptid-kapcsolásának a specificitását. A szintézis befejezése után az A-láncot flourhidrogénsawal ismert módon lehasítjuk a gyantáról és az aszimmetriás diszulfidokat szulfitolízissel [analóg a Hoppe Seyler, már az előbbiekben említett Z. Physiol. Chem, cikkével] S-tetraszulfonáttá alakítjuk és tisztítjuk. Az ily módon előállított és tisztított 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
