173101. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimtartalmú mikroorganizmus sejtek rögzítésére
5 173101 6 lát, 1,3-butilén-dimetakrilát, 1,6-hexametilén-diakrilát, etilén-diakrilát, dietüén-glikol-dimetakrilát, N.N’" -metilén-bisz-akrilamid, neopentil-gÜkol-dimetakrilát, 1,1,1-trimetilol-etán-trimetakrilát és a divinil-benzol. Keresztkötéseket kialakító monomerként előnyösen N,N’-metüén-bisz-akrilamidot használunk. A polimerizációs és kopolimerizációs reakciókat szabad csoportokkal iniciáljuk. Előnyösen olyan szabad csoport- iniciáló rendszert használunk, amely a sejtenzim hőérzékenységének megfelelő enyhe körülmények között a polimerizációhoz vagy kopolimerizációhoz megfelelő mennyiségű szabad csoportot biztosít. A fenti ofcból következően redoxiiniciáló rendszerek az előnyösek. Ilyen vegyületek a peroxidok, például az ammonium-, nátrium-vagy káliumperszulfát, benzoilperoxid és a di-(szek-butil)-peroxidikar bonát, amelyeket redukálószerekkel, például nátriumtioszulfáttal, nátriummetabiszulfittal, vas(III)-ammóniumszulfáthexahidráttal, dimetilamino-propionitrillel vagy ribolflavinnal használunk együtt. Iniciáló rendszerként előnyösen dimetilamino-propionitrilt használunk ammóniumperszulfáttal. A találmány szerinti eljárással előállított polimerizált készítmény összetétele, az összes monomer mólszázalékában kifejezve, széles határok között változhat: 15-90 % sejttel reagáló monomert, 0-60 % konomert és 1040% keresztkötéseket kialakító monomert tartalmazhat. Ez az arányú összetétel akkor is előnyös, ha a sejteket monomerhez, de akkor is, ha előzőleg elkészített polimerhez rögzítjük. Bizonyos esetekben a sejt enzim vesztes égének csökkentésére polifunkcionáis, keresztkötéseket kialakító reagensekkel kezeljük a sejteket. Bár az ilyen esetekben létrejövő reakció pontos mechanizmusa nem ismeretes, úgy látszik, hogy a polifunkcionáis reagensek egy csoportja a sejtmembrán aminocsoportjaival reagál, keresztkötéseket hozva létre, így erőteljesen csökkentve a membrán átjárhatóságát, a vegyületek egy másik csoportja úgy éri el ezt az eredményt, hogy a membránban jelenlévő karboxilcsoportokat aktiválja, amelynek ezután reakcióba lépnek a membrán aminocsoportjaival, amikor amidkötésjön létre. A fenti első vegyületcsoportba tartozik például a piroszőlősav-aldehid, glioxá, hidroxi-adipaldehid, cianurin-klorid, a tetraazatizált o-dianizidin, bisz-diazatizált benzidin, l,3-difluoro4,6-dinitrobenzol,toluol- 2,4- diizocianát és elsősorban a ^utáraldehid; a vegyületek másik csoportjába sorolható például a klórhangyasav- etilészter, a vízben oldódó karbodiimidek, például az l-etil-3-(3’-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidrogénklorid. Kezelhetjük a sejteket a reakcióképes monomerhez vagy polimerhez való kötésük alatt vagy után is. A sejtek rögzítésekor a kezelést vizes reakcióelegyben végezzük. A sejteket széles hőmérséklethatárok között kezelhetjük, előnyösen azonban 5 C° és 50 C°. előnyösebben 10 C° és 30 C° között végezzük a reakciót. A sejtek kezelése a hőmérséklettől és használt reagenstől függően általában 0,5-10, előnyösen 24 órát vesz igénybe. A kezelést a sejtek szárazsúlyára számítva általában 1-50, előnyösen 5-25 súly% mennyiségű reagenssel végezzük. A találmány tárgyát képező, kovalens kémiai kötések kialakításán alapuló, a sejtekből való enzimvesztést a lehető legkisebbre csökkentő kezeléssel kapcsolt sejtrögzítési eljárás során kapott vízben oldhatatlan polimer olyan állandó, rögzített enzimrendszert képvisel, amely szükségtelenné teszi az igényelt enzim elkülönítését. A találmány szerinti eljárással előállított termék álandósága és könnyen szűrhető, szemcsés alakja miatt előnyösen hasznáható mind recirkulációt igénylő, mind folyamatos működésű vizes, katalitikus kémiai eljárásokban. A találmány szerinti eljárást a következőkben pél dákkal szemléltetjük. 1. példa 80 g glicidil-metakrilátot adunk 1,0 liter vízhez, majd keverés közben 30 g N,N’-metilén-bisz-akrilamidot adunk az elegyhez. 15 percen át szobahőmérsékleten keverjük a reakció eledet, 10 g metil-metakrilátot adunk hozzá, majd 5 CT hőmérsékletre hűtjük, és 15 percen át nitrogént buborékoltatunk át a hideg elegyen. Ezután 20 ml dimetüamino-propionitrilt és 2 g ammóniumperszulfátot adunk hozzá. 10 C° hőmérsékleten, nitrogénatmoszféra alatt addig keverjük az elegyet, míg polimerizációs reakció indul meg. Ezt követően további egy órán át szobahőmérsékleten keverjük a szuszpenziót, végül 2 órán át állni hagyjuk. 750 ml vizet adunk a kapott szilárd halmazállapotú termékhez, majd a polimer megtörésére erőteljesen keverjük. Szűrjük a terméket, a szűrési maradékot vízzel mossuk, és levegőn szárítjuk, amikor 120 g fehér színű, szemcsés pohmerizátumot kapunk. Aspergillus nigert (NRRL-3; Pfizer Culture FD 2454) tenyésztünk, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, 33 Q*hőmérsékleten, 5,8-7,0 pH-ju, glükózt tartalmazó táptalajon, majd szűrjük a tenyészetet, a sejteket vízzel mossuk, és félig száraz pogácsát készítünk a szűrési maradékból, 250 g (55 g szárazsúly) sejtet 1000 ml, 22 g 25 súlyszázalékos vizes glutáraldehidet tartalmazó vízben szuszpendálunk. 6,2-re állítjuk be a szuszpenzió pH- ját, majd szobahőmérsékleten 1,75 órán át keverjük. Szűréssel elkülönítjük a szilárd halmazállapotú terméket, vízzel mossuk, amikor 104 g, az eredeti gjükóz-oxidáz aktivitás 76 %-át tartalmazó nedves, kezelt sejtet kapunk. 240 ml vízben 32 g nedves, kezelt sejtet és 16 g glicidil-metakrilát polimert szuszpendálunk, mq'd 30 percen át szobahőmérsékleten keverjük a szuszpenziót, végül szűrjük. Vízzel mossuk a szűrési maradékot, amikor 126 g nedves, az eredeti, kezeletlen sejtek aktivitására számítva 58 % glükóz-oxidáz aktivitást tartalmazó rögzített sejtet kapunk. 2. példa 20 ml acetonitrilhez 600 mg. 100 mg-onként 23 egység glükóz-oxidázt tartalmazó, az 1. példában megadott eljárással kezelt nedves Aspergillus nigert adunk, majd egyszerre 600 mg metakroükloridot és 400 mg trietilamint adunk a szuszpenzióhoz. 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük az elegyet, majd 20 ml vízhez öntjük, amikor az elegy pH-ja 6,03 lesz. Nitrogénatmoszféra alatt 1,3 g NjN’-metilén-bisz-akrilamidot, 750 mg metil-metakrilátot és 300 mg akrilsavat adunk a vizes elegyhez. Ezután 6,7« állítjuk be a pHját, és 0,5 ml dimetilamino-propkjnitrüt és 250 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
