173101. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimtartalmú mikroorganizmus sejtek rögzítésére
3 173101 4 tés kialakítására alkalmas csoportjaival reagáltatjuk, amikor kovalens kötések alakulnak ki egy vízben oldhatatlan polimer részecskéivel. A találmány szerinti eljárás foganatosításakor az ép mikroorganizmus sejteket kémiai kötésekkel rögzítjük a polimer reakcióképes csoportjain át a vízben nem 5 oldódó polimer részecskékhez. Amíg az izolált enzimeknek a polimerhez rögzítése kovalens kémiai kötésekkel ismert eljárás, addig az a felismerés, hogy az enzim forrásai az enzimnél nagyságrendekkel nagyobb teljes sejt kovalens kémiai kötésekkel szintén hatéko- 10 nyan rögzíthető, valóban meglepő. Ilyen kötések gyakran létrejönnek a sejt aminocsoportjainak és reakcióképes polimer-szubsztituensek reakciójával. Ezenfelül más, például hidroxil- és szulfidrilcsoportok szintén jelen vannak a sejtekben, és szerepet játszhatnak a kö- 15 tés mechanizmusában, mert a polimer aminocsoportokkal reakcióba lépő szubsztituensei, például az epoxid-, halogénkarbonil- és halogénmetil-karbonilcsoportok reagálnak a sejtekben jelenlévő hidroxil- és szulfidrilcsoportokkal. 20 A kémiai kötést létrehozhatjuk a polimerizáció előtt és után is. Az előző esetben úgy járunk el, hogy a sejteket érintkezésbe hozzuk a reaktív csoportot tartalmazó, polimerizálható, etilénesen telítetlen monomerrel, majd a sejtet hordozó monomert polimeri- 25 záljuk, vagy egy keresztkötéseket kialakító monomer és egy iniciáló rendszer jelenlétében kopolimerizáljuk. Az utóbbi esetben úgy járunk el, hogy a sejteket közvetlenül egy reakcióképes csoportot tartalmazó részecskékből álló polimerizátummal hozzuk érintke- 30 zésbe. A találmány szerinti eljárás előnyös foganatosítási módja szerint mind az elő- vagy utórögzítés esetén polimerizálható. Etilénesen telítetlen monomerekként, vagy az ezekből levezethető polimerekként olyan (I) 35 általános képletű vegyületeket használunk, ahol R, hidrogénatom vagy metilcsoport, W egy (IV) és (V) általános képletű csoport, ahol R2 halogénatom vagy 2,3-epoxi-propoxicsoport Y 2-3 szénatomos alkiléncsoport; n 1 vagy 2; Z hidrogénatom vagy halogénacetilcsoport. A rögzítésre előnyösen epoxi-, halogénkarbonil- és halogénmetil-karboníl-csoportokat tartalmazó monomereket vagy polimereket használunk. Előnyösen 45 olyan polimereket használunk, amelyek 2,3-epoxi-propil-metakrilát (glicidil-metakrilát), vagy brómacetil-hidroxietil-metakrilát monomerekből állnak. Olyan monomerek és plimerek esetén, amelyek^ nem tartalmaznak reakcióképes funkcionális csoportokat, például, ha az (I) általános képletben Z hidrogénatom, úgy a funkcionális csoportokat ismert eljárásokkal reakcióképes szubsztituensekké alakíthatjuk. Ezen eljárások során gyakran multifunkcionális kis- 55 molekulasúlyú reagenseket használunk. Ha az (I) általános képletben Z hidrogénatom, úgy a monomer vagy polimer hidroxilcsoportjait ismert eljárásokkal, halogénezéssel hasonlóképpen aktiválhatjuk, előnyösen brómacetil-bromiddal, brómcianid- go dal vagy 2-amino-4,6-diklór-l,3,5-tríazinnal. A találmány szerinti rögzítési eljárás a mikroorganizmusok sejtjeivel, például baktériumokkal, élesztőkkel, aktinomyces- ekkel és penészgombákkal is lefolytatható. Az eljárás különösen előnyösen használható 55 olyan sejtek esetén, amelyekben az elsődleges enzimrendszer oxido-reduktázokból, elsősorban oldódó ko-2 faktorokat nem igénylő glükóz-oxidázból áll; vagy ilyenek például a hidrolázok, mint például az Q^-amiláz és a peptidázok, elsősorban a penicillin-aciláz:liázok, elsősorban amelyek a szénatom-oxigénatom közötti kémiai kötéseket hasítják, és elsősorban a szénatom-nitrogénatom közötti kötéseket hasító fenilalanin-ammónia-liáz és az aszpartát-ammónia-liáz; az izomerázok, mint a racemázok, epimerázok, cisztransz-izomerázok és elsősorban a glükóz-izomé ráz. A találmány szerinti eljárás során előnyösen többek között a következő nemekhez tartozó baktériumokat használjuk; Pseudomonas, Xanthomonas, Acetobacter, Akaligenes, Flavobacterium, Escherichia, Aerobacter, Erwinia, Serratia, Proteus, Micrococcus, Sarcina, Lactobacillus, Bacillus, Nocardia, Streptomyces és Corynebacterium.Gombaként és élesztőként előnyösen a következő nemekhez tartozó organizmusokat használjuk: Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, Mucor, Fusarium, Pénicillium,Aspergillus, Glomerella, Rhizopus, Saccharomyces, Conidiobolus, Ryssochlamys, Candida, Chaetomium, Trichoderma, Septoria, Coprinus, Neurospora, Humucola és Trichosporon. Aktinomyces-ként előnyösen Micropolysporát használunk. A találmány szerinti eljárást különösen előnyösen használhatjuk az Escherichia coli, Bacterium cadaveris,Proteusrettgeri,Phodotorula gracilis, Pénicillium chrysogenum és Aspergillus niger fajoknál. A sejtek rögzítését a reakcióképes polimerhez vagy a monomerhez, ami utóbbit a monomer polimerizálása vagy kopolimerizálása követ, vizes reakcióé légyben végezzük. A polimerhez vagy monomerhez való rögzítést, vagy a monomerhez való rögzítést követő polimerizádót igen széles hőmérséklethatárok között végezhetjük, előnyösen azonban 5 C° és 50 C° előnyösebben 10 C° és 30 C° közötti hőmérsékletet biztosítunk. A rögzítéshez szükséges idő a reakcióelegytől és a rögzítés hőmérsékletétől függ, általában 0,5 és 35 óra közötti idő szükséges. A polimerhez való rögzítést előnyösen 15-30 a monomerhoz való rögzítést pedig előnyösen 1-5 óra alatt végezzük. A polimerizációk általában 1-6 óra alatt végbemennek. A polimer és a sejtek (szárazsúly) súlyaránya széles határok között változhat, előnyösen azonban 0,1:25, előnyösebben 0,5:4 arányt biztosítunk. Ha a sejtek a reakdóképes monomerhez kötődtek, a következő vizaddiciós polimerizádó difunkdonális, keresztkötéseket kialakító monomer és egy iniciáló rendszer jelenlétében egy vagy több komonomer mellett, vagy anélkül is végbemegy. A reakcióhoz használhatunk bármilyen olyan komonomert, keresztkötéseket kialakító monomert és iniciáló rendszert, amelyet ilyen típusú polimerizációnál általánosan használnak, és amelyek nem szüntetik meg a sejt enzimaktivitását. Komonomerként előnyösen sztirolt-, metil-metakrilátot, akrilsavat, [2-hidroxi-3-(l-[4-metil-piperazinil]) -propilj-metakrilátot vagy akrilamidot és legelőnyösebben metil-metakrilátot használunk. Keresztkötéseket kialakító monomerként, amely a végső polimernek három dimenzióban kiterjedő szerkezetet és vízoldhatatlanságot kölcsönöz, sokféle vegyületet, például akrilsav monomereket vagy olefineket, és más, az e területen jártas szakemberek előtt ismert vegyületet használhatunk. Ilyen monomer például az 1,3-butilén-diakrilát, eíilénglikol- dimetakri-
