173065. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-védett aminosavak extrakciójára
9 173065 10 (6R,7R)-3-acetoximetiI-7-(4-karboxibutanamido)-cef-3-em-4-karbonsav kipreparálására. Ezt a vegyületet oldószeres extrakcióval például csak igen körülményesen lehet elkülöníteni, mivel oldhatósága vízzel nem elegyedő oldószerekben általában kicsi. A találmány szerinti eljárás egy különösen előnyös felhasználási köre a cefalosporin C és a 3-hidroximetil cefalosporin-származékok, különösen a dezacetil-cefalosporin C extraktiv észterezése. A 3-hidroximetil-cefalosporin-származékokat a hagyományos eljárásokkal nehéz elkülöníteni a vegyületek - különösen savas körülmények között tapasztalható — erős laktonképződési hajlama miatt. A dezacetil-cefalosporin C laktonja kis antibiotikus aktivitású, stabilis vegyület, amely további félszintetikus cefalosporin-származékok előállítására sem használható fel. A 3-hidroximetil-cefalosporin-származékok karboxilát-sói ezzel szemben alig hajlamosak laktonképzésre; éppen ezért ezeket a származékokat jó hozammal lehet elkülöníteni a találmány szerinti eljárással. Az elkülönítés előtt a szóbanforgó cefalosporin-származékokat alkalmas előkezelésnek vetjük alá, így a 3-hidroximetil-cefalosporin aminocsoportját lúgos kémhatású vizes oldatban megvédjük. Az így készített oldathoz adjuk a diazoalkánt és a vízzel nem elegyedő oldószert, majd az észterképződés elősegítésére — a fent leírtak szerint — az erős savat. Ha dezacetil-cefalosporin C-t kívánunk elkülöníteni, akkor a vegyület aminocsoportját lúgos közegben, lúgfelesleg jelenlétében végrehajtott kezeléssel védjük meg. Reagensként alkalmas acilezőszert, például benzoilkloridot vagy halogénhangyasav-alkilésztert, bázisként alkálihidroxidot, így nátriumhidroxidot vagy puffert, például nátriumfoszfátot alkalmazhatunk. A kezelés után adott esetben lényegileg semleges pH-értéken (például 5-8 közötti pH-értéken) extrakcióval eltávolíthatjuk az N-védési reakció melléktermékeit, majd a reakcióelegyhez diazoalkán (például difenildiazometán) alkalmas oldószerben készült oldatát adjuk. A diazoalkán hozzáadása után az elegyet erős savval (például ásványi savval, így kénsavval vagy ortofoszforsawal) pH 2—4-ig, előnyösen pH 3,5-ig) savanyítjuk és így elősegítjük az extraktiv észterezés előrehaladását. Az elkülönítésben kiindulási anyagként alkalmazott dezacetil-cefalosporin C előnyösen lényegileg nem tartalmaz cefalosporin C-t. A dezacetil-cefalosporin C extrakciós úton történő elkülönítésének rendkívül nagy műszaki és gazdasági jelentősége van, mivel a Cefalosporium acermonium tenyésztésével történő cefalosporin C előállítás során a fermentlé általában jelentős mennyiségű dezacetilcefalosporin C-t tartalmaz. Ez az antibiotikum a cefalosporin C ismert eljárásokkal történő elkülönítése során nagyrészt kárbavész, a találmány szerinti eljárás segítségével azonban elkülöníthető és felhasználható. A találmány tárgyát képező extraktiv észterezést az elkülöníteni kívánt terméktől függően sokféleképpen alkalmazhatjuk cefalosporin-tartalmú fermentlevek kezelésére. A fér mentlevet kívánság szerint szűrjük vagy egyéb kezelésnek vetjük alá, majd észterázzal kezeljük és így a fermentlében jelenlévő cefalosporin C-t dezacetilezzük. Észteráz-forrásként előnyösen Rhodotorula családbeli élesztőt vagy e család mutánsát alkalmazzuk, így a Rhodotorula rubra törzs mikroorganizmusait. Az így készített termék szabad aminocsoportjait alkalmas reagenssel (benzoilkloriddal, klórhangyasav-etilészterrel) lúgos körülmények között kezelve megvédjük, majd a reakcióelegyet extraktiv észterezésnek vetjük alá. Ilyen módon lényegileg tiszta N-védett dezacetil-cefalosporin C-észtert állíthatunk elő. Ha a fermentlében lévő cefalosporin C és dezacetil-cefalosporin C aminocsoportjait a fenti észteráz-kezelés nélkül védjük meg, majd a kapott terméket a találmány tárgyát képező eljárás szerint észterezzük és extraháljuk, akkor N-védett cefalosporin C és dezacetil-cefalosporin C észterét különíthetjük el. Ezt a keveréket acetilező s z errel, például acetilkloriddal kezelve a dezacetil-származék acetilezhető és lényegileg tiszta N-védett cefalosporin C-észter állítható elő. A találmány szerinti eljárásban észterezőszerként használható diazoalkánokat a 802 112 lajstromszámú belga szabadalmi leírás szerint a megfelelő hidrazon oxidációjával állíthatjuk elő. Oxidálószerként szerves persavat, peijódsavat, hipohalogénsavat, hipohalogénsav-sót vagy észtert, krómsavat, klórt, brómot vagy pozitív halogénion-forrást, így N-halogén-amidot vagy imidet használhatunk. Különösen előnyös a perecetsav alkalmazása. Az oxidációt célszerűen bázis és oxidációs katalizátor, így jód jelenlétében végezhetjük. A találmány szerinti eljárást az alábbiakban — az oltalmi kör korlátozása nélkül - példák segítségével mutatjuk be. 1. példa (6R,7R)-7-(R-5-benz oilamino-5 -karboxipentánamido)-3-hidroximetil-cef-3-em-4-karbonsav-bisz-difenilmetilészter 6,0 g (10 mmól) 70%-os tisztaságú kálium-(6R,7R)-7-(R-5-amino-5-karboxipentánamido)-3-hidroximetil•cef-3-em-4-karboxilát 150 ml vízben készített oldatához hozzáadjuk 3,5 ml (30 mmól) benzoilklorid és 5 ml aceton elegyét. Az elegyet 1,5 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, eközben az elegy pH-ját 50%-os káliumfoszfát-oldat adagolásával 8,5 értéken tartjuk. Végül a reakcióelegy pH-ját ortofoszforsawal 5,0 értékre állítjuk be és az oldatot a benzoesav és a benzoilklorid eltávolítására 100 ml kloroformmal extraháljuk. A vizes oldathoz hozzáadunk 5 g (26 mmól) difenildiazometánt, 50 ml diklórmetánt és 10 ml etanolt tartalmazó 90 ml etilacetátot és az elegyet 45 percen keresztül keverjük. A keverés közben az elegyet ortofoszforsawal 2,0 pH-ig savanyítjuk. Az oldószeres fázis leválasztjuk, 100 ml 5%-os nátrinmhidrogén karbonát-oldattal, majd 100 ml vízzel mossuk. Az oldószert vákuumbepárlással eltávolítjuk, a párlási maradékként kapott gumit 30 °C-on 25 ml izopropanolban oldjuk. Az oldathoz hozzáadunk 10 ml 30-40 °C forráspontú petrolétert és az elegyet —5 °C-ra hűtjük le. A kivált terméket 10 ml petroléterrel mossuk és szobahőmérsékleten vákuumban megszárítjuk. Ilyen módon 10,5 g fenti végterméket kapunk. A terméket „GF254” szilikagél lemezen kromatografálva megállapítható, hogy az anyag csak nyomnyi mennyiségben tartalmaz szennyezéseket. A kromatografálásnál eluálószerként 80 : 20 : 1 arányú kloroform-aceton-ecetsav elegyet alkalmaztunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
