172931. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens szubsztrátumok vagy enzimaktivitások meghatározására
5 172931 6 nyilvánosságrahozatali irat vagy a 22 35 152 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat szerint és vérnek székletben történő kimutatására. Hogy az aszkorbátoxidáz a vérnek vizeletben való kimutatására szolgáló tesztpapí- 5 rokban funkcióképesen és stabilan tárolhatóan megmarad, rendkívül meglepőnek tekintendő. Ezek a tesztpapírok ugyanis szerves hidroperoxidokat tartalmaznak feleslegben, amelyektől a hidrogénperoxidhoz hasonlóan, az aszkorbátoxidáz inaktiválása 10 volna várható. Az aszkorbátoxidáz azonban egy külön hordozóra is felvihető, amelyet a többi reagens hordozójával, például erre helyezve, egyesítenek, összeragasztanak vagy összehegesztenek. Hordozóként különösen előnyös ebben az esetben az aszkorbátoxidáz számára az úgynevezett vízoldható papír (például a 24 36 598 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat szerint), amely a többi reagens hordozópapírján különösen jól felismerhetővé teszi a színreakciót. Ez a kiviteli alak különösen akkor előnyös, ha a reagenskombinációban olyan anyagok vannak jelen, amelyek az aszkorbátoxidázzal összeegyeztethetetlenek, például erősen savanyú reagensek, melyeket urobilinogén, bilirubin és nitrit meghatározására szolgáló eljárásoknál alkalmaznak. A fenti kiviteli alakoknál a reagens előállítására 1 ml impregnáló oldatra 5000 E mennyiségig, előnyösen 2000 E mennyiségig terjedő aszkorbátoxidázt alkalmazunk. 1 E/ml impregnáló oldat mennyiségnél kevesebb általában nem biztosítja a kívánt hatást. Úgy is eljárhatunk továbbá, hogy a hordozóanyag elkülönített zónáit impregnáljuk az aszkorbátoxidázzal, illetve a többi teszt-reagenssel. Ebben az esetben a hordozót célszerűen úgy hozzuk érintkezésbe a vizsgálandó oldattal, hogy az oldat először az aszkorbátoxidáz-tartalmú zónával érinttartalmazó zónába. Egy további kiviteli alak szerinti az aszkorbátoxidázt az enzimrögzítés oldhatatlan hordozón történő ismert módszerei szerint a hordozóanyagon kötjük meg. Megfelelő módszereket a 17 68 512 sz., 22 60 184 sz., nil-benziazolon-hidrazon(2) és tirozinázzal, illetve difenoloxidázzal. A következő példák kapcsán közelebbről ismertetjük a találmányt. 1. példa Glükóz meghatározása o-dianizidinnel, peroxidázzal (POD) és glükózoxidázzal (GOD), mérés fotométerben, hullámhossz 432 nm, a mérés hőmérséklete 25 C°. 15 Küvetta jelzése 1 2 3 4 5 foszfát-puffer, 0,1 mól pH 7,01 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 20 o-dianizidin, 5 mg/ml .'0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 POD, 180 E/ml 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 25 glükóz-oldat, 1 mg/ml 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 aszkorbin-30 sav-oldat, 10 mmól-0,1 0,01 0,1 0,01 VÍZ 0,12 0,02 0,11-0,09 35 aszkorbátoxidáz 500 E/ml-0,02 0,02 40 25 C° hőmérsékleten 1 percig inkubálunk, Ei értékét leolvassuk, majd indítunk a következő reagens hozzáadásával GOD, 70 E/ml 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 45 30 percig 25 C° hőmérsékleten inkubálunk, E2 értékét leolvassuk, E2— Ei-ből meghatározzuk E-t 21 28 743 sz., 24 26 988 sz., 50 22 60 185 sz., 26 03 158 sz. és a 19 15 970 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvános 55 ságrahozatali irat ismertet. A találmány szerinti eljárás előnyösen alkalmazható a következő módszereknél: glükóz meghatározása peroxidázzal, glükózoxidázzal és o-dianizidinnel vagy 2,2-azino-di-3-etil-benztiazolin-szulfo- 60 nát(6)-tal (ABTS), a glükóz meghatározása hexokináz/glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz-módszerrd, húgysav kimutatása fenollal, aminoanitipirinnel, peroxidázzal és urikázzal, tirozin vagy pirokatechin meghatározása SMBTH-val (4-metil-6-káliumszulfo- 65 E 0,541 0,010 0,316 0,540 0,543 Az 1-es jelű küvetta a zavartalan mérésnek felel meg (nincs aszkorbinsav jelen). A 2-es és 3-as jelű küvettával kapott érték azt mutatja, hogy 1, illetve 0r1 pmól aszkorbát a vizsgálatot teljesen, illetve 41,5%-ig terjedően gátolja. A 4-es és 5-ös küvettával kapott érték azt igazolja, hogy az említett aszkorbát-koncentráció által okozott hibát 10-10 E aszkorbátoxidáz adagolása teljesen kiküszöböli. 2. példa Glükóz meghatározása 2,2.’-azino-di-[3-etil-benztiazolin-szulfonát(6)]-tal (ABTS), POD-dal és 3
