172931. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens szubsztrátumok vagy enzimaktivitások meghatározására
7 172931 8 GOD-dal, mérés fotométerben, hullámhossz: 432 nm, a mérés hőmérséklete 25 C°. Küvetta jelzése 1 2 3 4 5 foszfát-puffer, 0,1 ml pH 5,6 2,75 2,75 2,75 2,75 2,75 ABTS, 50 mmól 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 POD, 250 E/ml 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 glükóz-oldat, 0,1 mg/ml 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 aszkorbinsav-oldat, 1 mmól 0,1 0,01 0,1 0,01 víz 0,12 0,02 0,11-0,09 aszkorbátoxidáz, 500 E/ml-0,02 0,02 25 C° hőmérsékleten 1 percig inkubálunk, Ej értékét leolvassuk, majd indítunk a következő reagens hozzáadásával GOD, 70 E/ml 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 30 percig 25 C° hőmérsékleten inkubálunk, E2 értékét leolvassuk, E2 —Ej-bői meghatározzuk AE-t AE 0,505 0,000 0,40 0,502 0,504 Az 1-es jelű küvetta a zavartalan mérésnek felel meg (nincs aszkorbát jelen). A 2-es és 3-as jelű küvettával kapott érték azt mutatja, hogy 0,1, illetve 0,01 jumól aszkorbát a vizsgálatot teljesen, illetve 21%-ig terjedően gátolja. A 4-es és 5-ös küvettával kapott érték azt igazolja, bogy 10—10 E aszkorbátoxidáz hozzáadása teljesen kiküszöböli az aszkorbátkoncentráciő által okozott hibát. 3. példa Hugysav meghatározása fenollal, aminoantipirinnel, POD-dal és urikázzal elemző automatában (AutoAnalyzer). A vizsgálat elve: húgysav + 02 + HTQ urikâ» allantoin + H202 2 H202 +2,4-dildórfenol + + 4-aminoantipirin £2£.kinoidális festék + + 2 H20 Az oldatok előállítása: 1 aszkorbátoxidáz-reagens 600ml kétszer desztillált vízben feloldjuk az 1 jelű üveg tartalmát. Hozzáadunk 0,3 ml Brij-35-öt. A reagensoldat sötét üvegben kb. 4C° hőmérsékleten 4 hétig, kb. 25 C° hőmérsékleten 1 hétig tárolható. 2 urikáz-reagens 800 ml kétszer desztillált vízben feloldjuk a 2 jelű üveg tartalmát. Hozzáadunk 2,0 ml Brij-35-öt. A reagensoldat sötét üvegben kb. 4C° hőmérsékleten 4 hétig, kb. 25 C6 hőmérsékleten 1 hétig tárolható. Az oldatok töménysége: 1 50mmó! foszfát-puffer, pH 5,6 aszkorbátoxidáz > a rajz 2. ábrájából látható mennyiség 2 31 mmól trisz/dtromsav, pH 8,9 urikáz 0,08 E/nd POD 0,015 E/ml 3,0 mmól 2,4-diklórfenol, 4,0 mmól 4-aminoantipirin. A meghatározás elvégzéséhez az l.ábra szerinti folyamatábrának megfelelően állítjuk össze az automata vezetékrendszerét. A 2. ábra grafikusan szemlélteti a kísérleti eredményeket. 4. példa Glükóz meghatározása HK/G6P-DH-val, NADP-vel, INT-tel és diaforázzal fotométerből. A mérés hullámhossza séklete 25 C°. 492 nm, az inkubálás hőmér-Küvetta jelzése 1 2 3 foszfát-puffer, pH 7,5, 0,1 mmól 1,7 1,7 1,7 NADP/INT egyenként 1 mg/ml 0,1 0,1 0,1 diaforáz, 5 E/ml 0,1 0,1 0,1 glükóz-oldat, 0,05 mg/ml 0,1 0,1 0,1 aszkorbát-oldat, 10 mmól-0,01 0,01 aszkorbátoxidáz, 35 U/nd— 0,03 víz 0,04 0,03 _ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
