172923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a digitális lanata és digitális purpurea növényekben előforduló digitoxigenin-glükozidok digoxinná, acetil-digoxinná, digitoxinná illetve gitoxiná történő átalakítására fermentáció útján
3 172923 4 Míg a szellőztetett helyiségben a fenti körülmények között állítólag lanatozid C képződik, megfigyelték, hogy egy „szűk, nem szellőztetett helyiségben” (pontosabb adat nincs) a lanatozid C gyorsan digoxinná bomlik. Ennek lehetséges okaként az O2-hiányt említik. A lanatozid C keletkezése a szerzők szerint a növényi sejt alapvető életfeltételeinek jelenlétén, így a víztartalmon és a gázcserén múlik. Az ismert eljárások, főleg az utolsónak említett eljárás hátránya az, hogy a lanatozid C-t csak levágott levelekben, nem az egész növényben lehet létrehozni, és hogy a digoxin feldúsítására 9 nap szükséges. Azonkívül a szükséges külső feltételek technikailag viszonylag nehezen valósíthatók meg. Az eljárás gazdaságos alkalmazása ezért nyilván nehézségekbe ütközne. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amellyel a lanatozid C és a digoxin elkülönítése során keletkező, a gyógyászatban csak részben felhasználható lanatozid A-t, illetve digitoxint szélesebb gyógyászati területen alkalmazható glikozidokká lehet átalakítani, illetve ezt az átalakítást a friss növény szabályozott fermentációja útján lehet elérni. Pitra és társai eredményeivel szemben meglepő módon azt találtuk, hogy légmentesen elzárt, előnyösen nitrogén- vagy széndioxidgázzal töltött edényekben 20 és 45 C° közötti hőmérsékleten a friss, aprított Digitalis laríata és Digitalis purpurea növényekben 60 óra alatt nemcsak a természetes lanatozid C, hanem a digitoxigenin-glikozidok egy jelentős része is enzimes hidroxileződés során digoxinná, részben gitoxinná is átalakul. Ez egyben azt is bizonyítja, hogy a digoxigenin-glikozidok szintéziséhez nem - ahogy Pitra és társai feltételeztek - szükségesek a növényi sejt alapvető életkörülményei, hanem ezek bizonyos fokig zavartak is lehetnek. Azt találtuk továbbá, hogy a digitoxigenin-glikozidok friss növényekből nyert és Sephadex WZ oszlopon tisztított növénykivonatok, liofilizált (Fischer F., Bärisch H., Schmidt H.-J.: Pharmazie 26, 769—770) vagy 35 C°-on szárított növényrészek segítségével digoxinná és gitoxinná alakíthatók át. A találmány tárgya tehát eljárás a Digitalis lanata és Digitalis purpurea növényekben előforduló digitoxigenin-glikozidok átalakítására digoxinná, acetil-digoxinná, digitoxinná illetve gitoxinná. A találmány szerint úgy járunk el, hogy friss vagy szárított Digitalis lanata, illetve Digitális purpurea növényeket vagy azok ismert módon való feldolgozása során nyert lanatozid A-t, dezacetil-lanatozid A-t, digitoxint vagy acetil-digitoxint 20 és 45 C° közötti hőmérsékleten legalább 60 órán keresztül a levegőtől elzárva és/vagy nitrogén- vagy széndioxid-légkörben a magában a növényben levő enzimek hatásának, illetve a fenti, friss vagy fagyasztva szárított vagy 30-40 C°-on szárított Digitalis növényekből nyert extraktum alakjában adagolt enzimrendszer hatásának tesszük ki, majd az átalakult anyagot önmagában isnfert módon tiszta digoxinná, acetil-digoxinná, digitoxinná, illetve gitoxinná dolgozunk fel. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy egy műveletben, sokkal rövidebb időn belül és kevésbé bonyolult körülmények között a digoxin és gitoxin digitoxigenin-glikozidokból történő postmortalis bioszintézise összekapcsolódik a természetes lanatozid C digoxinná, illetve a lanatozid B gitoxinná való bomlásával, aminek során a friss növényben viszonyítva a fermentált növényrészekben a digoxin mennyisége a digitoxigenin-glikozidok tartalmától függően nő. Az eljárást az 50 730 számú NDK-beli szabadalmi leírásban ismertetett magashőmérsékletű tartósítással lehet összekapcsolni, így a digoxin előállítása lényegesen gazdaságosabb módon valósítható meg. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük. A példákkal kapcsolatban megjegyezzük, hogy attól függően, milyen kiindulási növényt alkalmazunk, különböző végtermékek keletkeznek, mégpedig D. lanataból digitoxin, gitoxin és digoxin, D. purpureaból digitoxin és gitoxin. Közbenső termékként képződhet még acetil-digoxin, illetve acetil-digitoxin is. E közbenső termékeket dezacetilezéssel digoxinná, illetve digitoxinná alakíthatjuk (lásd: 1. példa), az utóbbiból a találmány szerinti fermentációs hidroxilezés útján szintén digoxin és gitoxin nyerhető. 1. példa 5 t frissen szedett Digitalis lanata leveleket (a szárított anyag 0,30% digjtoxigenin-giikozidokat és digoxinra átszámítva 0,30% digoxigenin-glikozidokat tartalmaz) körülbelül 1 cm nagyságú darabokra tépünk, és légmentesen elzárható silóban 1—2m magasságig összetömjük. A silóban légköri nyomású széndioxidlégkört létesítünk, és az anyagot 4 napon át tároljuk. Ez alatt az idő alatt a tépett levelek hőmérséklete 20 C°-ról 30C°-ra emelkedik. Utána a növényanyagot 120mp-en át 350-700 C°-ra felhevítve szárítjuk. A szárított anyag 0,51% digoxint és acetil-digoxint, valamint digoxinra átszámítva 0,09% digitoxint és acetil-digitoxint tartalmaz. A szárított növényanyagot súlyra vonatkoztatva 15-25 szőrös mennyiségű etilacetáttal extraháljuk. A kapott extraktumot vákuumban térfogatának 1/20 részére betöményítjük, majd azonos mennyiségű Miramid-porral (poliamidpor, gyártja: Leunawerke, NDK, a TGL 20055 számú szabvány szerint) keveijük, és a port szárítjuk. Utána a port 10-szeres mennyiségű 30—60%-os vizes metanollal eluáljuk. Az acetil-digoxin és acetil-digitoxin acetilcsoportjának lehasítása céljából az eluátumot nátriumkarbonáttal pH 10-re lúgosítjuk, utána kloroformmal kimerítően extraháljuk. A kloroformos extraktumot szárazra pároljuk, a maradékot tízszeres mennyiségű metanolban oldjuk, és víz-éter elegyet adunk hozzá, mire a digitoxin és gitoxin kiválik. A tiszta glikozidokat ellenáramú megosztással különítjük el egymástól. 2,5 kg digoxint és 0,5 kg digitoxint kapunk. A termékeket kvantitatív vékonyrétegkromatográfiával [a Pharmazie 27, 315-18 (1972) közlemény szerint] vizsgálva megállapítjuk, hogy a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
