172872. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peroxidáz enzim előállításra
3 172872 4 lítva az eljárás lényege az, hogy az enzimoldat dialízissel történő sómentesítésének kiküszöbölésére a kezdeti térfogatcsökkentést ammónium-szulfátos kisózás helyett bepárlással végzi. A tormalevet 40-45 C°-on vákuumban bepárolják, a sűrítményt folyóvízzel szemben négy napon át dializálják. A kapott dializátumból a nyers peroxidázt frakcionált oldószeres kicsapással nyerik ki: a dializátumhoz azonos térfogatú acetont adnak, a kiváló csapadékot centriíúgálással eltávolítják, majd a szűrlethez ötszörös térfogatú acetont adnak. Egy nap állás és dekantálás után a csapadékot centrifugán elválasztva, acetonnal mosva és P202 felett vákuumban szárítva kapják a nyers terméket, amelynek fajlagos aktivitása 100E/mg körüli. Az enzim további tisztítására desztillált vízben oldják, és a nyers enzimmel egyenlő tömegű, két hónapon át „öregített” kalcium-foszfát-gélt adnak hozzá. Ülepítés és centrifugálás után a felülúszóból ötszörös térfogatú absz. etanollal kicsapva, mosva és vákuumban szárítva jutnak a tisztított peroxidázhoz (fajlagos aktivitása átlagosan 200 E/mg). A 165 727 lajstromszámú magyar szabadalom szerinti eljárás jelentősebb hátrányai: a) Bár a peroxidáz viszonylag hőtűrő enzim, a tormalé bepárlása jelentős aktivitásveszteséget okoz. b) A bepárlás célja lényeges térfogatcsökkenés lenne, de már a térfogat 1/6-ára történő bepárlásnál olyan viszkózus folyadékot kapnak, amelynek kezelése (és további dialízise) rendkívül nehézkes. c) Az eljárás kiküszöböli az ammónium-szulfátos kisózást, hogy elkerülje a hosszadalmas, dialízises sómentesítést - a bepárlást követően mégis dializál, mégpedig nagyobb térfogatokat, mint a korábbi kicsapásos eljárások! A dialízis nemcsak hosszadalmas, hanem nagy hely- és munkaigényes művelet, sok vizet és drága hártyát igényel. d) A dializálást követően az enzim frakcionált kicsapására nagymennyiségű acetont és absz. etanolt használ. e) A soklépés es, hosszú technológia nem gazdaságos és sok veszteséggel jár, a kapott enzimek tisztasága és aktivitása nem felel meg az orvosdiagnosztikai tesztekben alkalmazott enzimekkel szemben támasztott minőségi követelményeknek. A találmány célja a fenti hátrányok kiküszöbölésével olyan üzemi eljárás kidolgozása, amely néhány egyszerű, kisebb veszteséggel járó és jó hatásfokú elválasztást biztosító művelettel nagy fajlagos aktivitású peroxidáz enzim előállítását teszi lehetővé. A találmány további célja, hogy a bepárlást, a hosszadalmas dialízist és a frakcionált kicsapás nagy oldószerfogyasztását kiküszöbölje. A találmány alapja az a felismerés, hogy az 50 és 70%-os telítési értékek közötti ammónium-szulfátos kisózással nagyfokú fehéijetisztítás érhető el a peroxidázaktivitás a többi vízoldható fehéije zömétől elválasztva gyorsan kis térfogatba sűríthető. A találmány további alapja az a felismerés, hogy az enzim további tisztításához nincs szükség dialízisre és frakcionált kicsapásra, mert megfelelő pórusméretű géllel töltött oszlopon kromatografálva a peroxidázt nemcsak a szervetlen sóktól, hanem egyéb szennyezőitől is egyetlen lépésben elválaszthatjuk. A találmány szerint úgy járunk el, hogy az ülepített extraktumból önmagában ismert módon végzett ammóniumszulfátos kisózással és centrifugálással az 50 és 70^os telítési értékek között kicsapódó fehéijefrakciót elválasztjuk, a kapott csapadékot 3-20-szoros, előnyösen 5-7-szeres mennyiségű desztillált vízben oldjuk, az oldatot 6000-es kizárási mólsúlynál kisebb pórusméretű géllel töltött oszlopon desztillált víz eluenst allfal, mazva kromatografáljuk, és a tisztított enzimoldatot önmagában ismert módon liofilizáljuk. A találmány szerinti eljárásban a tormából bármilyen módon nyert vizes extraktum felhasználható, ezért magából a tormagyökérből is kiindulhatunk. Ilyenkor célszerű a tormareszelék vagy -hántolék kétszeri extrahálásával kapott levekből kiindulni, mert viszonylag kis szárazanyagtartalom mellett így kapjuk a legtöbb aktivitást tartalmazó oldatot. A tormagyökér komplex felhasználása szempontjából azonban gazdaságosabb az ecetes torma és egyéb hasonló készítmények gyártásakor hulladéknak tekintett extraktlevek felhasználása kiindulási anyagként. Természetesen a találmány szerinti eljárásban tormapréslevek is használhatók. A kisózáshoz műtrágya minőségű, olcsó ammóniumszulfát használható, és bár viszonylag nagy mennyiségben szükséges (0,55 kg/liter tormalé), nem megy veszendőbe, mert az ammónium-szulfát oldatok fehérjetartalmuk miatt a kiindulási ammónium-szulfátnál értékesebb műtrágyák. Értékét csak növeli a nyomnyi mennyiségben a lében maradó peroxidáz, amelyről kimutatták, hogy a növényi érést serkenti, jobb gyökeresedést biztosít és a betegségekkel szembeni rezisztenciát növeli. Gélkromatografálásra azok a kis pórusméretű gyöngypolimerek alkalmasak, amelyek pórusaiba a 6000-nél nagyobb molekulasúlyú anyagok méretük miatt nem tudnak behatolni. Ilyen például a dextrán típusúak közül a Sephadex G-10 és a megfelelő Molselectek, a poliakrilamid típusúakra példa a Bio-Gel P2, P4 és P6, valamint a megfelelő Akrilex gélek. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a) Kiküszöböli a hosszadalmas és költséges dialízist. b) A korábbi eljárásoknál kevesebb lépésben és egyszerűbb műveletekkel jut a végtermékhez, ezért azonos mennyiségű nyersanyagból kiindulva több terméket ad. c) Az eljárás fajlagos energia- és anyagköltsége csökken (pl. a bepárlás és oldószeres frakcionálás kiküszöbölésével). d) A technológia átfutási ideje rövidebb. e) Lehetővé teszi kiváló minőségű (1000 E/mg-nál nagyobb fajlagos aktivitású) peroxidáz enzim jól reprodukálható üzemi előállítását. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
