172778. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens valamely szubsztrátum koncentrációjának enzimkinetikus meghatározására
13 172778 14 2. Gátlótípus 1 00 //liter 27,8-33,3-38,8-44,4- —50,0—55,5 mmól glükóz/liter szabvány-oldatot a küvettában 500 éditer mennyiségű, alábbi oldatokkal 25 C°-on inkubálunk: (a) puffer-enzim-elegy, 1+40 pufferrel hígítva, (b) 410 mmól/liter káliumtiocianát hígított puffer-enzim-elegyben, (c) 620 mmól/liter káliumtiocianát hígított puffer-enzim-elegyben. (A tiocianát-tartalmú oldatokat mindenkor frissen kell készíteni.) A reakciót 20 //liter 200 mmól/liter NAD® hozzákeverése útján indítjuk és az eredményeket 10 másodperccel utána rögzítjük: papírelőrehaladás 5 cm/perc, teijedés 20 cm E = 0—1-re. Az időtengellyel bezárt a szögnek a meghatározására a regisztráló feljegyzésének gyakorlatilag egyenes kezdeti tartományát értékeljük ki, a gátlótípus megállapításához a tanga reciprok-értékeit (gyakorlati célokra azonos a kezdeti sebességgel) ordinátaként, a kísérlet folyamán alkalmazott millimoláris glükózkoncentrációk reciprok-értékeit pedig abszcisszaként visszük fel (Lineweaver-Burk-diagram). Annak a kérdésnek a tisztázására, hogy a tiocianátozás okozza-e a gátlóhatást, a káliumtiocianátot ekvimolekuláris mennyiségű káliumkloriddal helyettesítjük. 3. Koncentrációmeghatározások Általános kísérleti anyag: 20 //liter próbát 500//liter stabilizált puffer-enzim-inhibitor-eleggyel a küvettában 25 C°-on inkubálunk és a reakciót 20//liter NAD® (150 mg/ml H20) hozzákeverése útján indítjuk. A reakció indulása után 20 másodperccel 5 cm/perc papírelőrehaladás mellett 366 Hg nm-nél és 1,00 cm rétegvastagságnál végzünk méréseket, az a szöget pedig mindenkor 20 másodperccel a reakció megindulása után állapítjuk meg. Számítás 5,55 mmól glükóz/liter tartalmú szabvány oldat útján: 5,55 So, próba= bing Apróba tang ^szabvány Humánplazmák elemzése: Próbákként olyan humánplazmákat alkalmaztunk, amelyeket fluoriddal — EDTA-val - benzoesawal — stabilizált vénás vérből centrifugálással kaptunk. Párhuzamos elemzéseket végeztünk a hexokináz-végértékmódszer szerint fehéijementesítéssel az AV 707 — T Eppendorf-előírás szerint, az előírástól való eltérésnél a szabványon keresztül számoltunk. Az eredmények értékelése Káliumtiocianát mint kompetitiv inhibitor 1. ábra egy Line weaver- Burk-diagram (ordináta: az extinkció-időgörbe reciprok növekedése 10 másodperccel a reakció indulása után, abszcissza: a kísérletnél alkalmazott reciprok millimoláris glükózkoncentráció). Az inhibitoradalék nélküli (a), 330 mmól KSCN/liter kísérleti oldat hozzáadásánál (b), valamint 500 mmól KSCN/liter kísérleti oldat hozzáadásánál (c) kapott egyenesek az ordinátát gyakorlatilag ugyanabban a pontban metszik, míg az abszcisszametszéspont növekvő inhibitorkoncentrációval a kezdőponthoz közeledik, amely a kompetitiv gátlótípusra jellemző. Méréstartomány és érzékenység A 2a és 2b ábrák kalibrációs görbéket ábrázolnak, amelyek akkor keletkeznek, ha a látszólagos Michaelis-állandót inhibitor hozzáadással 50 mmól glükóz/literre állítjuk be: egyszer az extinkcióidő-görbe emelkedésére 20 másodperccel a reakció kezdete után, másrészt 60, illetve 300 másodperc fixed-time-intervallumra, mindenkor ismét 20 másodperccel a reakció kezdete után (papírelőrehaladás 10 cm/perc, mérési hullámhossz 366 nm Hg). Az eljárás gyakorlati végrehajtására a következő pontok a lényegesek: 1. Amennyiben 3%-os hibát megengedünk a normálértékhatár felett (körülbelül 5 mmól/liter próba), a hígítás! határ szögleolvasásra, illetve a kisebb „time fixed”-intervallum 50 mmól/liternél van és ezzel még kedvezőbb, mint különböző hagyományos végértékmeghatározó eljárásoknál. A 300 másodperces intervallum esetében a kalibrációs görbe lineáris volta körülbelül 20 mmól/literig megfelelő. A körülmények fenntartása mellett azonban ezen az értéken túl csak kissé mehetünk túl, mert 2. az extinkciókülönbség a gyakorlatban használatos fotométerek méréstartományában túlságosan nagy, különösen akkor, ha gépesített mérésnél a minták sajátextinkcióját is figyelembe kell venni. A kísérleti körülmények változtatása útján (például nagyobb inhibitorkoncentráció, kisebb próbamennyiség) az érzékenység azonban csökkenthető és egyidejűleg a mérhető koncentrációtartomány kite/jeszthető. A szögleolvasás esetében, a 60-másodperces-intervallumnál az érzékenység például az NADH-abszorpciósmaximumhoz közeli mérés és/vagy a papírelőrehaladás sebességének csökkentése útján növelhető. Az eljárás érzékenységtartalékai olyan nagyok, hogy az alkalmazható koncentrációtartományt rövid mérésidő esetén is csak a fotométer mérési tartománya, illetve a gyakorlatban használt szögmérőeszközök leolvasási határa korlátozza. Az enzimkoncentrációnak a reagens készítőjének utasításán túli növelésére azonban nincs szükség. Pontosság és szabatosság Az eljárás pontossága az újratalálati arány, a hexokináz-végérték-módszerrel való összehasonlítás útján és kontroli-szériákkal vizsgálható felül. Az újratalálati arány (1. táblázat) nagyon jónak mondható. A hexokináz-végérték-módszerrel való , 5 I 10 IS 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
