172778. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens valamely szubsztrátum koncentrációjának enzimkinetikus meghatározására
7 172778 8 szerint hajtjuk végre, amelynél a pszeudo-elsőrendű reakciótartományban az összes mérésnél egy elemzéssorozatban azonos időszakaszban egy meghatározott választott idő után végzünk méréseket. Előnyösen a meghatározott választott idő után a mérési érték közlését az időszakaszban, a mérésre vagy egy kinetikus időpontmérést az időszakasz kezdetén vagy a végén vagy a pillanatnyi sebesség meghatározását egy meghatározott időszakban, például a mérőgörbe emelkedési szögének a meghatározása útján végezzük. Az időszakasz az elsőrendű reakciótípuson belül tetszés szerinti lehet, egy elemzési sorozaton belül azonban minden mérésre egyenlőnek kell választani. Ily módon gyakorlati és rövid mérésidőket választunk. Mindenekelőtt lehetséges egy célszerű, rövid mérésidőnek szükség szerinti beállítása is. Lehetőség nyílik arra is, hogy a kezdeti sebességet megállapítsuk („initial rate”-módszer). Bizonyos körülmények között kedvező lehet nem csupán egy, hanem több inhibitor használata is. Lehetőség van arra is, hogy a találmány szerinti eljárást többlépcsős reakcióknál alkalmazzuk, mimellett nincs szükség arra, hogy az összes részlépést enzimatikusan katalizáljuk. Például a kimutatandó szubsztrátumot egy sebességmeghatározó enzimatikus lépcsőben átalakítjuk, amelyhez egy gyors nem-enzimatikus indikátorreakció kapcsolódik. Ebben az esetben az indikátort az első (enzimatikus) reakciónál alkalmazzuk. Hasonló módon járhatunk el akkor, ha az indikátorreakciót is enzimatikusan katalizáljuk. Most azonban egy második lehetőség is adódik, miközben a tulajdonképpeni mérés előtt az első lépcsőt mennyiségileg hagyjuk lejátszódni és ennek reakciótermékei ezzel felhalmozódnak, ezt követően a második lépcsőt egy a második lépcsőnek megfelelő inhibitor hozzáadása mellett kinetikusán követjük. Egy különösen előnyös kiviteli módnál egy a mérendő anyagnak megfelelő puffert alkalmazunk. A különböző esetekben lehetséges részreakciókra való tekintettel emellett a puffer pH-értékét úgy választjuk meg, hogy az a mérendő anyag teljes reakciósebességének a tekintetében a pH-sebességmaximummal lehetőleg egyezzék és az enzim Km-értékét észrevehetően ne csökkentse. A találmány szerinti eljárás egy különösen meglepő hatása továbbá abban van, hogy a mintában esetleg már jelenlevő inhibitorok hatását, amelyek az elemzés eredményeit meghamisíthatnák, az inhibitorkoncentráció növelésével háttérbe tudjuk szorítani. Ilyenfajta zavaró reakciók a gyakorlatban nem éppen jelentéktelen szerepet játszanak, például a betegek vérszérumában jelenlevő sokféle gyógyszer gátlóan hathat. A természetben előforduló kísérőanyagoknak is van néha inhibitorhatása. A találmány szerinti eljárás lehetőséget nyújt arra, hogy olyan esetekben is megbízható elemzési eredményeket kapjunk, amelyekben valamely ismeretlen inhibitor nem ismert mennyiségben van jelen. A találmány tárgya továbbá a bevezetőben említett eljárás, amelyre az jellemző, hogy a meghatározandó szubsztrátum olyan oldatát alkalmazzuk, amely már egy kompetitiv gátlóhatást gyakorol a meghatározáshoz hasznait enzimre. Előnyösen a szándékosan hozzátett kompetitiv inhibitort olyan mennyiségben alkalmazzuk, amely az enzim 60—95%-os gátlását okozza. A legjobb eredményeket akkor kapjuk, ha a meghatározandó szubsztrátum-oldat már bizonyos gátlóhatást gyakorol a meghatározáshoz használt enzimre, amely az enzim egészen 50%-ig terjedő gátlását idézi elő. Az enzimkinetikus szubsztrátum meghatározásra alkalmas találmány szerinti eljárás, amely ismeretlen inhibitorok jelenlétében ismert inhibitoroknak ismert mennyiségben való adagolásával megy végbe, felettébb meglepő és megszünteti azt a szakemberek között elterjedt előítéletet, hogy kinetikus szubsztrátum meghatározás ismeretlen gátló anyagok jelenlétében nem lehetséges. így az Analytical Chemistry, 31, 988 (1959) folyóiratból ismert, hogy gátló aktivitások létezése az enzimatikus reakció számára az enzimatikus szubsztrátum meghatározás legsúlyosabb problémáját képviseli és egy ilyen meghatározás nem végezhető el akkor, ha ismeretlen és nem specifikus gátlóanyagok jelen vannak. Elsősorban arra történik utalás, hogy gátló anyagok maguk már nem határozhatók meg akkor, ha azok más gátló szennyezőket tartalmaznak. Az eljárás e kiviteli módjának a végrehajtásánál a fentiek hasonló módon érvényesek. Célszerűen azonban egy előzetes kísérlet során egy ismeretlen próbánál megállapítjuk, hogy az olyan gátló aktivitásokat foglal-e magában, amelyek az enzimet 50%-nál nagyobb mértékben nem képesek gátolni. Ez egyszerűen végrehajtható ismert mennyiségű szubsztrátum és ismert enzimaktivitás hozzáadása mellett. Amennyiben kinetikusán vagy végértékmeghatározással az adagolt szubsztrátum legalább 50%-át újra megtaláljuk, a találmány szerinti eljárás alkalmazható anélkül, hogy észrevehetően nagyobb hibával kellene számolnunk, mint egy gátlóanyagtól mentes oldatban való mérés elvégzésénél. Abban az esetben, ha az újratalált mennyiség jóval kevesebb, mint 50%, a találmány szerinti eljárás még mindig végrehajtható, azonban valamivel nagyobb hibával kell számolnunk. Az utóbbi esetben célszerű, ha a szándékosan adagolt inhibitormennyiséggel az alkalmazható gátlótartománynak egészen a felső határáig elmenjünk, ; amely körülbelül 95%-nál van. 40%-nál kisebb idegengátlás esetén előnyösen olyan mennyiségű kompetitiv inhibitort alkalmazunk, hogy 65 és 85% közötti enzimgátlást érjünk el. A találmány kiterjed továbbá valamely szubsztrátum koncentrációjának a találmány szerinti eljárással történő enzimkinetikus meghatározására alkalmas reagensre is. Egy ilyen reagens ennek az anyagnak az enzimkinetikus mérésére szolgáló rendszert foglal magában és az jellemzi, hogy legalább egy kompetitiv inhibitort tartalmaz a mérendő enzimanyagreakció számára. Alapjában véve ehhez a reagenshez megfelelnek a végérték-módszer szerinti enzimatikus szubsztrátum meghatározásra alkalmas ismert rendszerek, amelyek sokféle alakban a kereskedelmi forgalomban is előfordulnak. A találmány 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
