172778. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens valamely szubsztrátum koncentrációjának enzimkinetikus meghatározására
9 172778 10 szerinti reagens egy ilyenféle rendszer mellett ráadásul legalább még egy kompetitiv inhibitort tartalmaz. Inhibitor és enzim emellett valamely együttes komplex alakjában is előfordulhat, amely az enzim további stabilizálást segíti elő egy enzim szubsztrátum stabilizálásával analóg módon. Valamely anyag enzimkinetikus méréséhez használható rendszer általában egy a szubsztrátumra specifikus enzimet, egy ezzel az enzimmel összehangolt puffert, valamint adott esetben kofaktorokat és/vagy segédenzimeket és/vagy stabilizátorokat tartalmaz. Kofaktorok alatt itt koenzimeket, ezek között koenzimekként ható fémionokat, és egyéb segédanyagokat értünk. A találmány szerinti reagensek vagy reagenskombinációk mind oldatok formájában, mind pedig liofilizált, fagyasztva szárított elegyek alakjában készülhetnek. Egy különösen kedvező kiviteli alak liofilizált reagenseknek egycsöves küvettákban való elhelyezése, amely valamely oldószer (például puffer) hozzáadása után azonnal használatra kész és a meghatározás elvégzése után eldobható. A találmány közelebbi megvilágítására a következő példák szolgálnak. Hasonló módon határozható meg például koleszterin a koleszterin-dehidrogenáz-módszerrel vagy laktát az LDH-módszerrel. További olyan enzimkinetikus meghatározások, amelyek a találmány szerint kinetikusán elvégezhetők, például H. V. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie Weinheim, 1974, szakkönyvben le vannak írva. Az alábbiakban említett regressziós elemzést például H. V. Bergmeyer, K. Gawehn, Grundlagen der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1977 c. könyv ismerteti részletesebben. 1. példa Fotometriás húgysavmeghatározás a nem-kapcsolt urikáz-reakció szerint. Eközben az alábbi ismert reakció játszódik le: urikáz Húgysav + 2 H20 + 02 EC T7t~7t. 3 allantoin + C02+H202 Mérési adat a húgysav extinkciója ennek abszorpdós maximuma közelében 293 nm-nél van. Eszközök Eppendorf enzimmérőhely (fotométer 302 Hg-szűrővel, multiplier IP28 és lSHjg színkép lámpa. Eppendorf pipetták, illetve próba-reagens-adagolók. Reagensek 1. káliumtiocianát 2. húgysav 3. lítiumkarbonát 4.0,1 mól/liter borátpuffer, 9,5 pH 5. urikáz 5 egység/ml (sertésmájból előállítva) Munkamódszer Gátlótípus meghatározása 5 50 pliter 0,178-0,297-0,476-0,595-0,733—-0,892-1,19 mmól/liter húgysavat (amelyet 5,95 mmól/liter húgysavnak 54 mmólos lítiumkarbonátos törzsoldatából kétszer desztillált vízzel való hígítással készítünk) tartalmazó szabványos oldatot 10 500 pliter inhibitor nélküli pufferrel, illetve 500 pliter a küvettában (rétegvastagság 1,00 cm) 103 mmól/liter káliumtiocianátot tartalmazó pufferrel együtt 25 C°-on inkubálunk és a reakciót 50 pliter 1 + 10 kétszer desztillált vízzel hígított 15 urikáz hozzákeverése útján indítjuk. A reakció megindulása után 20 másodperccel regisztrálunk: papírelőrehaladás 2 cm/perc, terjedés 20 cm E = 0-l-re. A rögzítés kezdetén mindenkor megmérjük az időtengellyel bezárt a szöget. A tanga 20 reciprok-értékeit ordinátaként felvisszük a hozzájuk tartozó reciprok húgysavkoncentrációk függvényében (Lineweaver-Burk-diagram). A káliumtiodanát-hozzátéttel ellátott, illetve káliumtiocianát nélkül kapott pontokat a kiegyenlítő egyenesre 25 felvisszük. Egy kompetitiv gátlótípus fennforgása esetén a meghosszabbított egyeneseknek az ordinátát ugyanazon pontban kell metszeniük. A kísérleti körülmények optimalizálása 30 50 pliter szabvány-oldatot 500 pliter 825 mmól/liter káliumtiocianátot tartalmazó pufferrel 25 C°-on inkubálunk, a reakciót 50 pliter hígítatlan urikáz hozzáadásával indítjuk és a mérést az 35 előző módon végezzük. A látszólagos Michaelis-állandó meghatározásához a tanga reciprok-értékeit az ordinátára, a vizsgált anyag reciprok moláris anyagkoncentrációit pedig az abszcisszára visszük fel. A látszólagos Michaelis-állandó a regressziós 40 egyenesek abszcisszametszéspontjainak a negatív reciprok-értékeként jelentkezik (megfelelően kis értékek alkalmazása l/cs-re, azután grafikus kiértékelés). A K’m látszólagos Michaelis-állandók értéke fontos a kísérletben maximálisan alkalmazható han- 45 gyasavkoncentráció megítélésére, amelynek lehetőleg 0,05 K’M*nél kisebbnek kell lennie. Eredmények és értékelés 50 17 pmól/liter húgysav irodalmi értékkel a sertésmájból kivont urikáz Michaelis-állandójára [T.O. Tiffany és mtsai., Anal. Chem. 45, 1716-23, (1973)] 0,85 pmól/liter húgysav maximálisan használható koncentráció adódik, ha a kezdeti sebesség ss meghatározásának Cs/KM = 0,05 arány képezi alapját. Amennyiből 600 pliter kísérleti térfogatból indulunk ki, a felhasznált szérumrészt 0,85pliterre kell korlátozni annak érdekében, hogy a szérumban egészen 0,6 mmól/liter húgysav-tartalomig terjedő 60 mennyiséget mérni tudjunk. Eltekintve attól, hogy a szérumot előzetesen hígítani kell, mert egy ilyen 0,85 pliteres mennyiség közvetlenül nem adagolható pontosan, ilyen körülmények között magára a végértékmeghatározó eljárásra az alsó normál-érték - 65 határon humán-szérumok esetére (0,12 mmól/liter 5
