172778. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens valamely szubsztrátum koncentrációjának enzimkinetikus meghatározására
5 172778 6 tikai sorozatelemzéseknél stb. a naponta elvégezhető analízisek számának megsokszorozását teszi lehetővé. A Cs : Kfa arányt előnyösen 0,05 :1, különösen pedig 0,01 :1 alatti értékre állítjuk be. „Kompetitiv inhibitorokon” a találmány keretein belül két anyagcsoportot értünk: a) olyan anyagokat, amelyek (a tömeghatástörvény szerint) a szubsztrátummal az enzimért reverzibilisen versenyeznek, emellett azonban nem vagy csak elhanyagolhatóan lassan alakulnak át (hagyományos értelemben vett kompetitiv inhibitorok), b) olyan anyagok, amelyek a meghatározandó szubsztrátumot reverzibilisen megkötik és ezáltal annak szabad koncentrációját (a tömeghatástörvény szerint) csökkentik, mimeÜett a szubsztrátum inhibitor-komplex az enzim hatása következtében nem alakul át. Megfelelő kompetitiv inhibitorokként előnyösen olyan anyagokat választunk, amelyek a reakciósebességet meghatározó reakció kiindulási anyagainak és/vagy végtermékeinek egyikével szerkezetileg rokonok, de az ennél a reakciónál alkalmazott enzimmel nem lépnek reakcióba. A találmány szerinti eljárásnál a mérés a nagyobb anyagátalakulás miatt pontosabb, ezenkívül egyszerűbb eszközökkel lehet dolgozni. Egy mérési időtartomány előnyösen 0,5 perc és 3 perc között van. A reakciósebesség és az anyagkoncentráció közötti arányosság oly mértékben közeledik egymáshoz, hogy analitikai célokra megfelelő pontosságot érhetünk el. Az eljárás sokoldalúsága és a körülményekhez való alkalmazhatósága az ismert eljárásokhoz képest jelentősen javul azzal, hogy a szubsztrátum koncentrációnak az enzimhez és a kompetitiv inhibitorhoz való aránya egy analitikai célokra megfelelő érzékenységű és a mérésre alkalmas, kisebb szubsztrátum koncentrációnál is beállítható és a mérés gyakorlatilag kedvező időszakaszban végezhető. Ezzel összefüggésben egy célszerű kiviteli mód szerint egyrészt a reakciósebesség és a szubsztrátum koncentrációk közötti arányosságot az inhibitor hozzáadása útján javítjuk, másrészt a reakciósebesség csökkenését az enzimkoncentráció növelésével kompenzáljuk. A reakciósebesség növelését a reakcióhőmérséklet emelésével is elérhetjük. Egy kompetitiv inhibitor alkalmazása ellenére az enzinűconcentráció növelése kedvezően hat akkor is, ha az érzékenységet növelni kell és ugyanazon mérési időben nagyobb átalakulást kell megvalósítani, amely a mintában ismét a reakciósebesség és a szubsztrátum koncentráció közötti arányosság javulásához vezet. Mindenekelőtt az enzimkoncentráció növekedésének nem kell viszonylag rövid mérési idő alatt megtörténnie, mivel a reakciósebesség a kompetitiv inhibitor koncentrációjának a megválasztásával tetszés szerint vezérelhető. Ebből a találmány értelmében az a döntő előny adódik, hogy nagyobb szubsztrátum koncentrációknál hagyományos eszközökkel lehet méréseket végezni gyakorlati mérésidőben. Különösen lehetőség van arra, hogy a minta mennyiségének, az enzim koncentrációjának és az inhibitor koncentrációjának megfelelő megválasztásával a mintában valamely szubsztrátum minden fontos koncentrációtartományában előzetes vagy utólagos hígítás nélkül mérhessünk. A szakemberek figyelmét eddig teljesen elkerülte az a lehetőség, hogy a kompetitiv inhibitoroknak ezt a hatását enzimkinetikus meghatározások céljára ki lehet használni. A hatást utólag azzal lehet megvilágítani, hogy az előzőekben leírt Michaelis-Menten-féle egyenlet nevezőjébe pótlólag még egy additív tagot viszünk be: W cs v—--------------------------------cs+ Km+Km* cj* Kj Ebben a képletben csi Kj = -----------ha a szubsztrátum kötött és cs* Cl CEI Kj= -------------, ha az enzim kötött, cE * ci ahol Ci = az inhibitor koncentrációja, Cgi = a szubsztrátum/inhibitor-komplex koncentrációja, c§ = a szubsztrátum koncentrációja, cEj = az enzim/inhibitor-komplex koncentrációja, cE = a szabad enzim koncentrációja. Mivel a KM+ KM • q • Kj(= K’M a látszólagos Michaelis-állandó) mindig nagyobb, mint KM, a v reakciósebesség és a cs szubsztrátum koncentráció közötti arányosság egy meghatározott időközben nagyobb szubsztrátum koncentrációknál érhető el, mint ahogy ez egy kompetitiv inhibitor hozzáadása nélkül lehetséges. A találmány értelmében a szabad enzim koncentrációját és a cEi/cE, illetve cSi/cs viszonyt úgy hangoljuk össze a szubsztrátum koncentrációval, hogy megfelelő aránynál kielégítő érzékenységgel mérhetünk. A találmány egy további előnye abban van, hogy az érzékenység nem csak a szubsztrátum- és enzimkoncentrációval, hanem a kompetitiv inhibitorral is szabályozható. Ilyen körülmények között előnyös, ha Ids szubsztrátum koncentrációk biztos meghatározásához a megfelelő érzékenységet a c§ szubsztrátum koncentráció-, a cE enzimkoncentráció- és a q kompetitiv inhibitorkoncentráció-arány útján állítjuk be. Abban az esetben, ha egy esetleges hosszabban tartó üresjáratot nem kell megvárni, ez célszerűen egy üresérték felvételével javítható. A mérést célszerűen a keverék homogenizálása és egy esetleg fellépő hőmérsékletnövekedés kiegyenlítése u+án előnyösen a „time fixed”-módszer 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
