172666. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új mikrobiális proteázok előállítására
Azt találtuk, hogy a fenti Thermoactinomyces vulgaris törzset meghatározott tápközegben tenyésztve a hőálló komponensek hozama jelentősen növelhető. Ezt úgy éljük el, ha a tápközeghez a termelőszakaszban kukorica-extraktumot, keményítőt, nátrium- és kalciumkloridot, élesztő-extraktumot, ecetsavat és növényi olajokat adunk. A felsorolt komponensek jelenléte a tenyészoldat proteolitikus aktivitását az eddigi hozamokhoz képest 4—5-szörösére növeli. Meglepő módon a továbbiakban azt találtuk, hogy a kukorica-extraktumot tartalmazó tápközeg beadagolásakor a hatékony hőálló komponensek lényegesen nagyobb mennyiségben képződnek, mint más, ThermDactinomyces-törzsek tenyésztéséhez felhasznált tápközegben. Ezek az Agre-féle táptalajok a következő összetétellel rendelkeznek: oldható keményítő 10 g pepton 5 g kukorica-extraktum 5 g NaCl 5 g CaCl2 0,5 g deszt.víz 1 000 ml-re kiegészítve pH 6,5—7,0 A Thermoactinomyces vulgaris IMET 9515 által képzett enzimkomplex a találmány szerinti tenyésztés során 70-72 C° hőmérsékletoptimummal rendelkezik, ami csaknem azonos a ficin (68 C°) hőmérsékletoptimumával, és hőállósága jobb, mint a ficiné. 80 C° hőmérsékleten az enzimkomplex 80%-a hatékony, ugyanakkor a ficin aktivitása 80 C°-on megközelítően 40%. 90 C°-on még 60% aktív, míg a ficin ezen a hőmérsékleten csaknem teljesen inaktívvá válik. A Thermoactinomyces vulgaris IMET 9515 enzimkomplexének aktivitása alacsony hőmérsékleten (10 C°) a hőmérsékletoptimumban uralkodó aktivitásnál 3%-kal kisebb. Ez a tulajdonság rendkívül kedvezően hat például ezzel az enzimmel kezelt hús tárolhatóságára. Továbbá a port mort ális applikálás során az optimális érlelő hatás eléréséhez meglepően csekély proteáz aktivitás szükséges, ami más mikrobiális proteázok ugyanazon mennyiségének kb. 1/4—1 /10-e. A találmány szerinti eljárás során felhasznált törzset valamint annak egy mutánsát Jénában az NDK központi törzsgyűjteményben (Zentralinstitut für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie) deponáltattuk IMET 9515 szám alatt. A törzs az alábbi jellemzőkkel rendelkezik: a) A hifák átmérője 0,3—0,5 ß, kissé elágazó, szálas tagolt szubsztrát és légmicéliumok képződnek. A légmicéliumok terminális- vagy oldalágakból valamint a szubsztrát-hifák ív alakban felfelé hajlított részeiből állnak. b) A spórák egyenként laterálisán képződnek a lég- és a szubsztrát-micéliumokon hordozó-hifák nélkül. Átmérőjük 0,5-8 ß. A kerek alakú spórák szegélyszerű vastagodásokkal rendelkeznek, amelyeket külső membrán vesz körül. c) Az agar-lemezen a szervezetek kicsi világosszürkétől fehérig színezett kissé kidomborodó kolóniákban nőnek. 6—8 órával a tenyésztés kezdetét követően kifejlődik a szubsztrát-micélium, 16-18 óra elteltével a légmicélium és a spórák kialakulnak. A folyadékos állókultúrákban a felületben zárt micéliumréteg képződik, amelyben azután spórák képződnek. Rázott tenyészetben diffúz növekedés figyelhető meg. d) Vad törzs esetén a szubmerz tenyészetben főként gömb alakú micéliumok képződnek, az enzimtermelés erősen lecsökken. Ezzel szemben a mutánsok morfológiai képét egyenletes diffúz növekedési forma jellemzi, az enzimtermelés állandó. e) Mind az emerz mind a szubmerz tenyésztésnél a mutánsok a vad törzsnél erősebb spóraképződést mutatnak. f) Az enzimtermelés a szubmerz kultúrákban a mutánsoknál korábbi időpontban következik be, mint a vad törzseknél. g) A vad törzs szubsztrát-micéliumából sárga pigmentek választhatók le. A mutánsok szubsztrát-micéliumai azonos körülmények mellett nem képeznek pigmenteket. h) A törzseket az alábbi Agre-féle összetételű táptalajon tartjuk: oldható keményítő 10 g pepton 5 g kukoricaextraktum 5 g NaCl 5 g CaCl2 0,5 g agar 20-25 g deszt.víz 1000 ml pH 6,5-7,0 i) Tartósított törzseket készíthetünk felületi kultúrákból a spórák sovány tejjel történő leúsztatásával és ezt követően fagyasztásos szárítással. j) A mutánsok a vad törzzsel szemben két-háromszorosan nagyobb proteolitikus aktivitással rendelkeznek. A találmányt az alábbi példák szemléltetik. 1. példa Thermoactinomyces mutáns (IMET 9515 Jéna) 5 napos Agre-féle ferde-agar tenyészetéből, amelyet szénából vagy komposzt ból izoláltunk, kacs segítségével 15 ml Agre-féle táptalajba (50 ml tápoldat) oltóanyagot viszünk és 6 órán át 45 C°-on kerek rázógépen inkubáljuk. Az előkultúrából 30 literes fermentort oltunk be, amely 15 liter alábbi összetételű tápoldatot tartalmaz: Alap tápközeg: kukoricaextraktum 1,0% keményítő 1,0% nátríumklorid 0,5% kálciumklorid 0j05% Adalékok: repceolaj 0,2% száraz élesztő 0,3% 1 n ecetsav pH- 6,5-7 fi 0,5% A hőmérsékletet 40 C°-on tartjuk. A keverő fordulatszán» 320 U/min. Percenként levegőt vezetünk a tápoldatba 2 rész tápoldatra 1 rész levegőt számítva. 16 óra elteltével a fermentor tartalmát 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
