172666. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új mikrobiális proteázok előállítására

5

i u. Óbb

6

elkülönítjük. A „felülúszó” proteázaktivitása legfeljebb 6 /imól/ml. A ,/elülúszó”-t koncentráljuk és etanollal, illetve szerves sókkal kicsapjuk, majd vákuumban szárítjuk.

5

2. példa

A Thermoactinomyces vulgáris törzs IMET 9515 szám alatt deponált mutánsának száraz spóra-konzerváturnából kacs segítségével az alábbi összetételű 10 tápközegen ferde-agar kultúrát létesítünk:

0,3% száraz élesztő 0,5% pepton

0,5% sovány tejpor (pH 7,0). 15

20 órás (56Cö-on végzett) tenyésztés után a spórákat 0,01 %-os Tween-80 (polioxietil-szorbitán-monoleát) oldattal lefejtjük.

Az oldattal 500 ml-es lombikban levő 150 ml fenti összetételű folyékony táptalajt beoltunk és 20 6 órán át 50 C°-on kerek rázógépen inkubáljuk.

30 literes fermentorban levő 20 liter alábbi összetételű tápoldatot az előkultúrából vett 5% inokulummal oltunk be.

Alap tápközeg:

kukorica-extraktum

1,0%

keményítő

1,0%

nátriumklorid

0,5%

kálciumklorid

0,05%

Adalékok:

repceolaj

0,2%

száraz keményítő

0,3%

1 n ecetsav (pH - 6,8-7,0)

0,5%

A tenyészetet 50C°-on 160 U/min. fordula számú rázógépen 3 órán át inkubáljuk. 500 ml té fogatú gömblombikban levő 50-50 ml 1. péld szerinti összetételű tápoldatot 0,5 ml előkultúráv, beoltunk. 16 órán át 50 C°-on a kerek rázógépe inkubáljuk, majd a micéliumot elkülönítjük, t „felülúszó”-ban 0,3 jumól tirozin mutatható ki.

4. példa

A felületi tenyésztést a 3. példa szerinti modor végezzük. A ferde-agar kultúrákból a spórákat 0,01 %-os Tween 80 (polioxietil-szorbitán-monoleát', oldattal leúsztatjuk és a szuszpenzióból 0,1%-ot át

viszünk 2 literes fermentorba, amely

1 liter alábbi

összetételű tenyészközeget tartalmaz.

Alap tápközeg: kukorica-extraktum

1,5%

keményítő

1%

NaCl

0,5%

CaCl2

0,05%

Adalékok: repceolaj

0,02%

száraz élesztő

0,5%

(pH 7,0-7 ,2)

A tenyésztést 50 C°-on végezhetjük. A keverés sebessége 500 U/min. A levegőztetést 1 rész tápközegre számítva 1 rész levegővel végezzük. 24 óra elteltével a micéliumot elkülönítjük. A ,/elülúszó” proteázaktivitását ml-ként 2,3 /amol tirozinnal határozzuk meg.

A tenyésztést 50 C°-on végezzük. A keverő for- 35 dulatszáma 320 U/min. A levegőztetést percenként 2 rész tápoldatra 1 rész levegőt számítva végezzük. Körülbelül 20 óra elteltével a fermentor tartalmát elkülönítjük. A „felülúszó” proteázaktivitása legfeljebb 6 /rmól/ml (56 C°, kazein). Az enzimet koncent- 40 rátum formájában vagy etanollal, illetve szerves sókkal végzett frakcionált kicsapást követően száraz készítményként alkalmazhatjuk.

3. példa

45

A Thermoactionmyces vulgaris törzs IMET 9515 mutánsának száraz spóra-konzervátumából ferde-agar kultúrát létesítünk kukoricaextraktumot és keményítőt tartalmazó közegben. A 20 órán 56 C° vég- 50 zett tenyésztést követően a képződött spórákat 0,01%-os Tween 80 (poüoximetil-szorbitán-monoleát) oldattal lefejtjük. A szuszpenzió 1%-val előtenyészetet létesítünk. Az előtenyészet táptalaja az alábbi összetételű: 55

pepton sovány tej száraz élesztő CaCl3

0,5%

0.5%

0,3%

0,05% 60

Szabadalmi igénypontok:

1. Eljárás a Thermoactinomyces vulgaris IMET 9515 számon deponált törzse és mutánsa egy meghatározott hőálló proteolitikus enzimének előállítására, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést kukorica-extraktumot vagy gabonatermékeket élesztőt, növényi olajat és ecetsavat illetve acetátot tartalmazó táptalajban, 6,8—7,2 pH- és 45-56 C° hőmérséklet-tartományban 16-24 órán át végezzük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a táptalajban 0,5—3,0% kukorica-extraktumot vagy 50% szárazanyag-tartalmú gabonaterméket alkalmazunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypontok szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 0,1-3% élesztőt tartalmazó táptalajt alkalmazunk.

4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 0,05—3,0% növényi olajat tartalmazó táptalajt alkalmazunk.

5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 0,1—1,0% 1 n ecetsavat, illetve acetátot tartalmazó táptalajt alkalmazunk.

A kiadásért felel: a Közgazdaság» és Jogi Könyvkiadó igazgatója 794033 - Zrínyi Nyomda

3