172618. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterinoxidázt termelő mikroorganizmusok enzimtermelésének növelésére
5 172618 6 tenyésztési eljárásnál a mikroorganizmusok átlagos tartózkodási idejét a két fokozatban célszerűen égy állítjuk be, hogy az a második fokozatban 4— 8-szorosa az első fokozatének. Ezt egyszerűen úgy valósíthatjuk meg, hogy állandó átfolyási sebesség mellett a második fokozat tartályának térfogata 4—8-szor nagyobb, mint az első fokozat tartályáé. A mindenkori legcélszerűbb tartózkodási idő mégis bizonyos mértékig ingadozik az egyes mikroorganizmusoknál, és speciális mikroorganizmusokhoz célszerű azt előkísérletek útján meghatározni. Általában kedvezőnek bizonyul két sorbakapcsolt tartályt alkalmazni, 0,25—0,30 térfogat/óra átfolyási sebességgel az első, és 0,05-0,065 térfogat/óra átfolyási sebességgel a második tartályban, a koleszterin-emulzió hozzáadása a második tartályban történik. A következő példák a találmány további megvilágítására szolgálnak. 1. példa 2 liter táptalajt - amely 0,5 súly% kazein pepton, 0,05 súly% dikáliumhidrogénfoszfát 0,2 súly% ammóniumhidrogénfoszfát 0,02 súly% magnéziumszulfát-heptahidrát, nyomnyi mennyiségű vasklorid és kalciumklorid káliumhidroxiddal pH 7,5-re beállított vizes oldata - rázólombikban beoltunk 200 ml Nocardia erythropolis NCIB 9158 tenyészet inokulummal és mágneses keverővei történő keveréssel erősen levegőztetjük. Az inokulumot a következőképpen állítjuk elő: 4C°-os hűtőszekrényben tárolt ferde-agar mikroorganizmus tenyészetet (standard 2, Merck, No. 7881) 50 ml bouillon-ra (standard 1, Merck, No. 7882) oltunk le, és a folyékony tenyészetet rázókészülékben inkubáljuk, 10 és 24 óra közötti időtartamban, ami a tenyészet növekedésétől függ. Az inkubálást az optikai sűrűség mérésével követjük, és addig folytatjuk, míg az oldatból kivett minta 1 :20 arányú hígításban 0,400 értéket ér el (400—600 m hullámhossztartományban). Ezután ezt a tenyészetet használjuk egy 200 ml-es, ugyanilyen táptalajt tartalmazó lombik beoltására, mikor is a beoltást 20 ml tenyészettel végezzük, és az inkubálást ismét a 0,400 értékű optikai sűrűség eléréséig folytatjuk. A logaritmikus növekedési szakasz megindulásakor — ami a zavarosság fellépésének fokozódásáról ismerhető fel - nedves őrléssel előállított sterüezett vizes koleszterin-szuszpenziót adunk hozzá folyamatosan a további tenyésztés folyamán oly módon, hogy 20 órán belül összesen 10 g koleszterint mérünk be a lombikba. A koleszterin nedves őrlése azért előnyös, mert az induláló hatás finoman eloszlatott formában lényegesen jobb. Az utolsó hozzáadás után 5 árával a sejtmasszát centrifugálással elválasztjuk, és Így 4 g baktérium-szárazanyagot kapunk. Ultrahangos feltárás után 3E/g koleszterinoxidázt nyerünk. Ennél 1 E az enzim azon mennyisége, amely 1 perc alatt 1 M koleszterint oxidál, azaz 1 M H2Oa-ot képez. Az enzimaktivitás mérése a következőképpen történik: 2,31 ml pH 7,0 értékű 0,5 mólos foszfátpufferhez, mely 1 mg/100 ml mennyiségnek megfelelő 2,2 ’-azino-di(3-etil-benztiazolin-szulfonát)-ot tartalmaz, 0,05 ml 0,37%-os butanolos koleszterinoldatot, valamint 0,6 ml butanolt, 0,02 ml (5 E-nek megfelelő) (Boehringer Mannheim gyártmány) peroxidázt adunk, és a reakciót a megfelelő 0,02 ml baktériumextraktummal indítjuk be. (a baktériumextraktum előállítását lásd a 6. példa 1. bekezdésében). Az extinkcióváltozást percenként mérjük, 436 nm hullámhosszon, és a keletkezett H202-ot standard görbével történő összehasonlítással állapítjuk meg. A reakció hőmérséklete 37 C°. A további példákban az inokulum előállítása és az enzim aktivitás mérése a fentiekben megadottak szerint történik. 2. példa Alkalmas tenyésztőedényben az 1. példában leírt táptalaj 15 literét beoltjuk 0,5 liter jól kifejlett Nocardia erythropolis ATCC 17 895 előtenyészettel 0,7 liter/1/perc levegőztetés közben. Rögtön kezdetben hozzáadunk 0,05% koleszterint. A logaritmikus növekedés megindulásától kezdve (ennek kritériuma azonos az 1. példában leírttal) a további tenyésztés folyamán hozzáadunk sterüezett koleszterin-szuszpenziót, úgy hogy 15 órás tenyésztési idő alatt összesen 50 g koleszterint viszünk be a fermentorba. 40 g baktérium-masszát kapunk, melyből ultrahangos feltárással 7,1 E/g koleszterinoxidázt nyerünk. 3. példa A 2. példában leírtak szerint Nocardia erythropolis NCIB 9158 törzset 60 liter munkatérfogatban tenyésztünk. 25 óra múlva elkezdünk a tenyésztőedénybe friss táptalajt adagolni és azonos mértékben kiveszünk a benőtt tápoldatból. A hígítás foka (átfolyási sebesség/munkatérfogat) eközben 0,04. Egyidejűleg koleszterin-szuszpenziót adagolunk be a fermentorba, úgyhogy óránként 3 g koleszterint mérünk be. Ilyen módon folyamatos tenyésztéssel 1,2—1,5 g/liter baktérium-szárazanyagot kapunk, ugyanazzal a fajlagos aktivitással, amit a 2. példában leírt szakaszos eljárással kapunk. 4. példa 20 literes fermentorban 15 liter táptalajt — amely 0,5 súly% ammónium-acetát, 0,05 súly% szekunder kálium-foszfát, 0,2 súly% primer ammónium-foszfát, 0,02 súly% magnézium-szulfát-heptahidrát, nyomnyi mennyiségű vasklorid és kálium-klorid folyóvizes oldata — beoltunk 0,5 liter Nocardia erythropolis NCIB 9158 előtenyészettel és erőteljes levegőztetés mellett tenyésztjük (600 liter levegő per óra, keverési fordulatszám 600 fordulat per perc, a keverő lapátátmérője 120 mm). A tenyészet pH-ját 20%-os ecetsav folyamatos hozzáadásával állandó értéken tartjuk, az ecetsav-hozzáadást addig folytatjuk, amíg a biomassza tömény-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
