172618. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterinoxidázt termelő mikroorganizmusok enzimtermelésének növelésére
3 172618 4 feltárják és extrahálják a sejteket, az extraktumot anioncserélőre visszik fel, és az enzimet felületaktív szert tartalmazó pufferoldattal eluálják. Mikroorganizmusként a találmány szerinti eljárás megvalósításához — mint említettük — elviig minden koleszterint átalakító mikroorganizmus felhasználható. Különösen jó eredményeket érhetünk el a Proactinomyces családba tartozó baktériumokkal és közöttük előnyben részesül a Nocardia erythropolis N BC 9158, ATCC 17 895, ATCC 4277 és Nocardia formica ATCC 14 811. A találmány szerinti eljárás azonban ugyanígy más mikroorganizmusokra is alkalmazható, melyek képesek a koleszterin átalakítására. Az említett különösen előnyben részesített mikroorganizmusoknak koleszterinen, mint kizárólagos szénforráson való tenyésztésénél fennáll a probléma, hogy a koleszterin vízoldhatósága nagyon csekély, és emiatt a fermentor falain lerakódik. Ennek az a következménye, hogy a szaporodó mikroorganizmusok adszorbeálódnak, bezáródnak, és így kilépnek a tápoldatból. Oldószerek, mint alkoholok, ketonok hozzáadásának az a hátránya, hogy ezeket az anyagokat mint szénforrásokat a mikroorganizmusok előnyben részesítik, és ezáltal a koleszterinoxidáz-tartalom erősen csökken. Szokásos emulgeátor hozzáadása növekedésgátláshoz vezet. Ezt a nehézséget a 22 24 133 számú NSZK-beli nyilvánosságra hozatali irat szerint úgy győzik le, hogy a mikroorganizmusokat peptontartalmú ásványisó táptalajon tenyésztik, és amikor elérték a logaritmikus növekedés szakaszát, vizes emulziót adunk hozzá, melyet vizes koleszterin-szuszpenzió nedves őrlésével és hősterilizálásával állítottak elő. így a kitermelés 1-2 g tiszta sejt-szárazanyag. Az emulziót olyan mennyiségben adják a tápfolyadékhoz, hogy a növekedés során literenként összesen 1-20 g koleszterint adnak hozzá. A hozzáadást célszerűen részletekben végzik el a mikroorganizmusok növekedésének az arányában. Kismennyiségű koleszterint, előnyösen már a növekedés kezdetén, tehát a logaritmikus növekedési szakasz elérése előtt hozzáadnak a tápfolyadékhoz. Táptalajként 0,1-2 súly% peptont, 0,01-0,2 súly% dikáliumhidrogénfoszfátot 0,05—1 súly% ammóniumdihidrogénfoszfátot 0,05-0,1 súly% magnézium-szulfát-heptahidrátot, nyomnyi mennyiségű vaskloridot és kalcium-kloridot tartalmazó, 6—9 pH-jú vizes oldatot használnak. A kezdeti koleszterin-hozzáadás célszerűen 0,01-0,1%. Ezzel a munkamódszerrel 7 egység specifikus koleszterinoxidáz-tartalom érhető el 1 gramm baktérium-szárazanyagból és mintegy 1 —3,5 gramm baktérium-szárazanyagot kapnak 1 liter táptalajból. Azt találtuk, hogy lehetséges az említett mikroorganizmusok specifikus koleszterinoxidáz-t art almát többszörösére emelni, és egyidejűleg a tápoldat 1 literére eső baktérium-szárazanyag mennyiségét megkétszerezni. Ez úgy érhető el, hogy olyan mikroorganizmust használunk, amelyet először acetáton és utána koleszterinen mint egyedüli szénforráson tenyésztünk tovább. A találmány ezen különösen előnyös kivitelezési formája azon a meglepő megállapításon alapszik, hogy a szénfonásnak a táptalajban való egészen speciális - a fentiekben definiált — elosztásánál a mikroorganizmusok koleszterinoxidáz-tartalma erősen megnő és ebből kifolyólag még egyébként azonos feltételek mellett is a mikroorganizmus-kitermelés lényegesen emelkedik, összehasonlítva a peptontápanyag használatával. így, ha mikroorganizmusokat a fentiekben leírt összetételű ásványisó-táptalajon tenyésztjük, de benne a peptont 0,5 súly% acetáttal helyettesítjük a koleszterinemulzió hozzáadásáig (amit az 1 :20 hígítású tápoldat kereken E =0,25 értékű zavarosságánál kezdünk meg) 24E/g szárazanyag fajlagos aktivitást érünk így el. Egyidejűleg azonban a szárazanyag-tartalom is 6,5 g/literre emelkedik, tehát több mint 100%-kal nő. A szárazanyag-tartalom és aktivitás további jelentős fokozása érhető el, ha a fent leírt vizes koleszterin-szuszpenzióhoz emulgeálószerként kismennyiségű, 0,02-1 súly, előnyösen 0,05—0,3 súly% élesztőkivonatot adunk. Kedvező eredményeket kapunk a találmány ezen előnyben részesített kivitelezési módjánál ammónium-acetát formájában jelenlevő 0,1—2 súly% acetáttartalomnál. Más acetát, például kálium- vagy nátrium-acetát használatánál ekvimolekuláris mennyiséget alkalmazunk. A koleszterin főmennyiségét akkor adjuk a tápoldathoz, ha a mikroorganizmusok elérik a logaritmikus növekedés szakaszát, tehát amikor a gyorsuló növekedés szakasza a logaritmikus fázisba megy át. Ez összefüggésben van Monod definíciójával, mely szerint a mikroorganizmusok növekedési fázisainak sorrendje: kezdeti nyugvó szakasz, gyorsuló növekedés szakasza, logaritmikus növekedés szakasza és csökkenő szaporodás szakasza. A hozzáadás egy vagy több adagban, vagy pedig folyamatos adagolással történik. Egy a találmány szerint különösen előnyben részesített táptalaj ezért 0,1—2 súly% acetátot (ammónium-acetát formában), 0,01-0,2 súly% dikáliumhidrogénfoszfátot 0,05—1 súly% ammóniumdihidrogénfoszfátot 0,05-0,1 súly% magnéziumszulfát-heptahidrátot, nyomnyi mennyiségű vaskloridot és kalcium-kloridot tartalmazó, 6—9 pH-jú vizes oldat. A fent meghatározott növekedési fázis elérésekor az acetátot koleszterinnel helyettesítjük. Mivel a pH-érték a tenyésztés folyamán emelkedne, ezért folyamatosan vagy adagokban savat adunk a tápoldathoz, úgyhogy a pH közel állandó marad. Sav gyanánt ecetsavat használunk abban a növekedési fázisban, ahol szénforrásként acetátot alkalmazunk, amikor koleszterin-szénforrásra térünk át, az ecetsavat ásványi savval helyettesítjük. Ebben a második növekedési stádiumban előnyösen sósavat használunk a pH-érték szabályozására. Különösen célszerűnek bizonyult egy kétfokozatú, azaz két tartályban végrehajtott folyamatos tenyésztés, mivel ilyen módon a biomasszára vonatkoztatva optimális koleszterinoxidáz-aktivitások érhetők el. A találmány ezen előnyben részesített kivitelezési formájánál sikerült 30E/g szárazanyag-aktivitást elérnünk. Ennél a kétlépcsős folyamatos 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
