172604. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin kinyerésére fermentáció útján
11 172604 12 5. táblázat folytatása Törzs (OD) Anyag Mennyiség mg/dl Növekedés (OD) AJ-3460 0,430 guanin 5 0,320 0 0.090 AJ-3461 0,400 B12-vitamin + 0,01 + 50 0.300 + L-leucin o + o 0,075 AJ—3463 0,451--0,512 5. kísérlet 15 aminosavak, keverékben vagy külön-külön, tenné szétes nitrogéntartalmú anyagok, például élesztő-A Corynebacterium AJ—3397 (FERM P—1613) és Corynebacterium lilium AJ-3464 (FERM P—2026) mutánsokat szintén a 3. kísérletben leírt módszerre] kaptuk. Az AJ-3397 kiindulási törzse 20 a Micrococcus glutamicus ATCC 13032, az AJ-3664-é pedig a Corynebacterium lilium NRRL B—2243 (ATCC 15990) volt, amelyek rendszertani tulajdonságai a 3 087 863 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban lettek közölve. 25 A találmány előnye az ezen a szakterületen eddig ismert és általában alkalmazott módszerekkel szemben az, hogy olyan újfajta mutánsokat képes produkálni, amelyek kitűnnek nagy L-lizin-termelő- 30 képességükkel, ugyanakkor ez az L-lizin-termelőképesség nem függ túlságosan a táptalaj treoninvagy más tápanyag-tartalmának ingadozásaitól, a lizin-analógokkal szemben mutatott rezisztencia miatt. 35 Ami a táptalajt és a tenyészkörülményeket illeti, hagyományos, a minő sav termelésre használt fermentációs eljárások és táptalajok éppenúgy alkalmazhatók, mint a speciálisan lizin előállítására használt táptalajok, illetve fermentációs eljárások. 40 Ily módon mind szintetikus táptalajt, mind természetes eredetű táptalajokat alkalmazhatunk a fermentáció során, feltéve, hogy az alkalmazott fajták növekedéséhez szükséges esszenciális tápanyagokat tartalmazzák. Ezek a tápanyagok közismerten azok 45 a szénforrások, nitrogénforrások és szervetlen sók, amelyeket az alkalmazott mikroorganizmusok felhasználnak életműködésük során. Megfelelő szénforrásként alkalmazhatók például a szénhidrátok, mint például a glükóz, fruktóz, 50 maltóz, szacharóz, keményítő, keményítőhidrolizátum, melasz, vagy más megfelelő széntartalmú vegyület, például szerves savak (ecetsav, propionsav, fumársav stb.), vagy egyéb szerves vegyületek (benzoesav, metanol, etanol vagy más alkoholok). Ezek 55 az anyagok egymagukban vagy keverékeikként is alkalmazhatók. A felhasznált mikroorganizmusok asszimilálóképességétől függően, szénhidrogének is alkalmazhatók kisebb-nagyobb mennyiségben szénfor- 60 résként a táptalajban. Nitrogénforrásként különböző szerves és szervetlen sók vagy vegyületek alkalmazhatók. Ilyen például a karbamid, ammóniumklorid, ammóniumszulfát, ammóniumnitrát, ammóniumfoszfát stb., 65 kivonat, húskivonat, halhús, húsleves, pepton, bouillon, kazein hidrolizátum, rizskorpa extraktum stb. Ezeket az anyagokat szintén lehet egyenként vagy keverékekként alkalmi i az adott körülményeknek megfelelő módon. A táptalajban felhasználható szervetlen vegyületek a következők: magnéziumszulfát, nátriumfoszfát, káliumdihidrogénfoszfát, dikáliumhidrogénfoszfát, vasszulfát, vagy egyéb vassó, mangánklorid, kalciumklorid, nátriumklorid stb. A táptalajban a mutáns növekedéséhez szükséges minden tápanyagnak jelen kell lennie. A növekedést serkentő anyagok és egyéb, csak nyomokban szükséges tápanyagok, amelyek növelik a terméshozamot és az L-lizin termelés hatásfokát, például a következők: szerin, prolin, alanin, leucin stb., különféle vitaminok, mint például B12, tiamin, pantoténsav, nikotinamid vagy nikotinsav stb., purin-bázisok például guanin, adenin és a hipoxantin, szójabab fehérjehidrolizátum, élesztőkivonat, pepton, kazein hidrolizátum stb. Fontos, hogy az aminosav és egyéb tápanyag mennyiségét a mikroorganizmus növekedéséhez szükséges optimális koncentrációnál alacsonyabb értéken tartsuk, ami általánosan alkalmazott módszer fermentációk során. A fermentációt 24 C° és 37 C° közötti hőmérsékleten 24—96 órán keresztül, aerob körülmények között, rázatással vagy keveréssel és levegőztetéssel végeztük. A pH-értéket 5 és 9 között tartjuk, amikor a pH 5 alá kezd csökkenni, a fermentlé pH-értékét például kalciumkarbonát vagy vizes ammóniumhidroxid oldattal semlegesítjük. Ha szénforrásként szerves savakat használunk a fermentáció folyamán, a pH emelkedik, ebben az esetben a pH szabályozása sósavval vagy kénsawal történik. A képződött L-lizin kinyerése a fermentléből ismert módszerekkel történhet. A baktériumsejtek eltávolítása szűréssel vagy centrifugálással történhet, az L-lizin kinyerése pedig a visszamaradt oldatból kationcserélő gyantákkal történhet. A találmány szerint előállított L-lizint papírkromatográfíásan, Rf-értéke alapján, valamint elektroforézissel, mikrobiológiai vizsgálattal és lizin-dekarboxilázzal szembeni viselkedés alapján azonosítottuk. A következő példák a találmány szerinti eljárást közelebbről ismertetik. 6
