172604. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin kinyerésére fermentáció útján
5 172604 6 A minimáltáptalaj összetétele a következő: 2g/dl glükóz, 1 g/dl ammóniumszulfát, 0,3 g/dl karbamid, 0,1 g/dl káliumdihidrogénfoszfát, 0,04 g/dl kristályos magnéziumszulfát, 2 ppm Fe- és Mn-ion, 0,05 mg/liter biotin és 0,2 mg/liter tiamin hidroklorid, a közeg pH-ja 7,2. E minimáltáptalajhoz a kísérlet során a megfelelő aminosavból 30 mg/dl-t, 10 mg/liter kalciumpantotenátot vagy 100 mg/liter adenint adtunk, és a mutánsokat a fenti táptalajokkal 31 C°-on 24 órán keresztül rázatva inkubáltuk. A tenyészeteket ezután kezdeti térfogatuk 26-szo- 5 rosára hajtottuk és 562 nm hullámhosszúságnál mértük az optikai sűrűséget (fényabszorpció mérés). Az eredményeket az 1. táblázat mutatja. 1. táblázat Fajta Optikai sűrűség minimáltáptalaj (OD) a tenyészetben kiegészítő tápanyaggal Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 0,400 Brevibacterium lactofermentum ATCC 21798 0,065 0,410 (szerin) Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799 0,059 0,405 (Ca pantotenát) Brevibacterium lactofermentum ATCC 21800 0,380 0,075 (tiamin hiányzott) Brevibacterium lactofermentum ATCC 21801 0,052 0,375 (adenin) 2. kísérlet 30 Brevibacterium lactofermentum A Brevibacteríum lactofermentum ATCC 13869 törzset 250 jug/ml nitrozoguanidinnel 30 C°-on 30 percig kezelünk, majd a következő összetételű agar-táptalajra oltjuk: 35 2 g/dl glükóz, 0,3 g/dl karbamid, 1 g/dl (NH4)2S04, 0,5 g/dl treonin, 0,1 g/dl KH2P04, 0,04 g/dl MgS04 • 7H2 O, 2 ppm Fe- és Mn-ion, 50 pg/liter biotin, 0,2 mg/liter tiamin hidroklorid, 5 mg/ml AEC és 2 g/dl agar, a táptalaj pH-ja 7,0, az inku- 40 bálás 4—10 napon keresztül 31 C°-on történt. A telepek izolált AEC-rezisztens törzseket ezután L-lizin-termelőképességre vizsgáltuk, és a megfelelőnek mutatkozó mutánsokat kiválasztottuk. 45 A mutánst (amely AEC-rezisztens, de külön tápanyagot nem igényel) ismét kezeltük 0,25 mg/ml nitrozoguanidinnel 30 percen keresztül 30 C°-on. Ezután a megfelelő mutánsokat, melyek L-lizin-termelő képességük mellett még AEC-rezisztensek és 50 külön hiánymutánsok is voltak, szokásos eljárással izoláltuk. A mutánsok tápanyagszükségletének megállapítása szokásos módszerekkel történt. Ezen a módon a következő hat törzset kaptuk: 55 Brevibacterium lactofermentum AY—3391 (AEC7 + Pro} Brevibacterium lactofermentum AY—3392 (AEC7 + nikotin- 60 amid"+ Leu") Brevibacterium lactofermentum AY-3393 (AEC7 + Ser"+ Leu") Brevibacterium lactofermentum AY—3395 (AEC7 + nikotinamid") 65 AY—3396 (AEC7 + hipoxantin}. E hat mutáns fajtaváltozat tápanyagszükségletét a következő eljárással határoztuk meg: Először minimáltáptalajt készítettünk, melynek összetétele a következő: 2% glükóz, 0,3% karbamid, 1% (NH4)2 S04, 0,1% KH2P04, 0,04% MgS04 • 7H20, 2 ppm Fe” 2 ppm Mn++, 0,05 mg/liter biotin és 0,2 mg/liter tiamin • HC1, pH = 7,2. Ennek a táptalajnak 3 ml-ét, a 2. táblázatban feltüntetett tápanyaggal kiegészítve, beoltottuk a fenti hat mutánssal (amelyeket előzőleg Bouillon-talajon neveltünk) és 24 órán keresztül 31 C°-on, levegőztetés és keverés közben tenyésztettük- A kapott tenyészeteket 26-szorosra hígítottuk, az oldatok fajlagos fényabszorpcióját 562 nm hullámhossznál mértük. Az eredményeket a 2. táblázat tartalmazz^. 2. táblázat Fajta Minimál táptalaj Növekedés (OD) kiegészítő tápanyag ATCC 13869 0,400-AJ—3391 0,058 0,440 (40 mg/ml prolin) AJ—3392 0057 0,420 (0,5 mg/dl nikotinamid + 40 mg/dl leucin) 3
