172604. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin kinyerésére fermentáció útján
7 172604 8 2. táblázat folytatása Fajta Minimál táptalaj Növekedés (OD) kiegészítő tápanyag 5 AJ-3393 0,052 0,460 (50 mg/dl szerin + 40 mg/dl leucin) 10 AJ—3394 0,058 0,390 (0,01 mg/dl Bi 2) 15 AJ—3395 0,055 0,430 (1 mg/dl nikotinamid) AJ—3396 3. kísérlet 0,059 0,420 (5 mg/dl hipoxantin) 20 A Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 törzset 0,25 mg/ml nitrozogiianidinnel 30 C°-on 25 30 percig tartó kezelés után a következő összetételű agar-táptalajra oltottuk: 2g/dl glükóz, 0,3g/dl karbamid, 1 g/dl (NH^SO^ 0,4g/dl treonin, 0,1 g/dl KH2P04, 0,04 g/dl 30 MgS04 • 7H20, 2 ppm Fe- és Mn-ion, 0,05 mg/liter biotin, 0,1 mg/liter tiamin • HCl, 4 mg/ml AEC és 2 g/dl agar, a pH = 7,0 és 31 C°-on 4-10 napon keresztül inkubáltuk. Az agar-lemezeken levő telepekből az AEC rezisztensnek mutatkozó tenyésze- 35 teket izolálás után L-lizin termelőképesség szempontjából vizsgáltuk. A 872-es mutánst ily módon kaptuk. Az AEC-rezisztens, de nem hiánymutáns 872-es 40 törzset úgra 0,25 mg/ml nitrozoguanidinnal kezeltük, 30 C -on, 30 percen keresztül. A kezelés után kapott tenyészetekből a megfelelő, nagymennyiségű L-lizin termelésére képes, AEC-rezisztens és megfelelő tápanyagigényű mutánsokat ismert módszenei 45 izoláltuk. Az így izolált mutánsok tápanyagszükségletét szokásos módszerekkel határoztuk meg. A következő két mutáns, amelyek életfolyamataikhoz alanint, illetve alanint vagy valint igényelnek esszenciális tápanyagként és AEC rezisztenciával is rendelkeznek, jó L-lizin-termelő törzsek. Brevibacterium lactofermentum AY—3424 (AEC^ + Alá") Brevibacterium lactofermentum AY—3425 (AEC^ + Alá' vagy VaH Az AY-3424 mutánst az előzőekben már ismert módon újra kezeltük nitrozoguanidinnel. Ily módon az AY-3429 törzset kaptuk, amely AEC-rezisztenciával rendelkezik, tápanyagigénye pedig alanin és leucin, ezen felül jó L-lizin-termelő képességű. E három törzs tápanyagigényét a következő módszerrel vizsgáltuk: Minimáltáptalajt készítettünk a következő összetétellel: 2% glükóz, 0,3% karbamid, 1% (NH4)2S04, 0,1% KH2P04, 0,04% MgS04 • 7H2 O, 0,05% NaCl, 2 ppm Fe”, 2 ppm Mn++, 0,05 mg/liter biotin, 0,2 mg/liter tiamin • HC1, pH = 7,0. A három mutánst 24 órán keresztül, 31 C°-on Bouillon-ban szaporítottuk, ezután 6—6 ml alábbi minimál-táptalajba oltottuk. A mikrobákat tartalmazó szuszpenziók optikai sűrűsége (OD) 0,250 az AJ—3424 és 0,295 az AJ—3425 esetében. Az előbbi minimáltáptalaj 3ml-ét a 3. és a 4. táblázatokban feltüntetett esszenciális tápanyagokkal kiegészítve, a három sejtszuszpenzió 0,1 ml-ével beoltottuk. A tenyészeteket ezután 24 órán keresztül 31 C°-on inkubáltuk rázatás és levegőztetés közben. Az optikai sűrűség meghatározása céljából a táptenyészetet eredeti térfogatának 26-szorosára hígítottuk, majd 562 nm-es hullámhossznál mértük az abszorpciós koefficienst. Az eredményeket a 3. és a 4. táblázat tartalmazza. Kiegészítő koncentráció Növekedés (OD) Tápanyag mg/dl AJ-3424 AJ-3425 Nincs 0,027 0,025 0,068 0,070 L-alanin 50 0,185 0,152 0,170 0,176 D-alanin 50 0,155 0,162 0,236 0,250 Valin 50 0,058 0,080 0,160 0,210 Nik. 0,5 0,045 0,037 0,066 0,071 Treonin + 50 + met ionin 50 0,022 0,020 0,072 0,076 4
