172238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavicepaminok előállítására
5 172238 6 A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi egy új, eddig ismeretlen bázikus fehérje-csoport, és ezzel egy új, biológiailag aktív, elsősorban tumorgátló hatású termékcsoport előállítását. Az eljárással nyert klavicepamin termékek vízben jól oldódnak, nem bomlékonyak, így megbízható gyógyszerhatóanyagul szolgálhatnak. A lizingazdag fehérjék természetes előfordulása és általános fiziológiai szerepe arra utal, hogy terápiás alkalmazásuk egy természetes reguláció elvén alapul. A találmány szerinti eljárással nemcsak a Clavicepsfajok által termelt új vegyületcsoportot sikerült előállítanunk, hanem önmagában az előállításukra szolgáló eljárás is új, amely a Claviceps-fajok által termelt anyagok kinyerésénél ezideig nem került alkalmazásra. Az eljárás újdonsága abban foglalható össze, hogy a Claviceps-fajok szűrt fermentlevéből, vagy extraktumából első lépésben a nagymolekulasúlyú anyagokat nyerjük ki, amelyekből ezt követően a lizingazdag fehérjéket szelektíven kioldjuk, majd az így kapott oldatból a terméket kicsapjuk. A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példák szemléltetik : 1. példa A modellkísérlet leírása Az OKI nemzeti törzsgyűjteményében 22/1964. szám alatt letétbe helyezett Claviceps purpurea törzs vegetatív tenyészetét sterilezett táptalajra oltjuk, melynek összetétele a következő : 100 g szacharóz 10 g borostyánkősav 1 g kalcium-nitrát 0,25 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,25 g magnézium-szulfát 0,125 g kálium-klorid 0,009 g vas(ll)-szulfát 0,003 g cink-szulfát 2,5 g agar-agar ad 1000 ml desztillált víz. A táptalaj pH-értékét sterilezés előtt tömény ammóniumhidroxid oldatta! 5,6-ra állítjuk, majd400—400ml-t 1 literes Erlenmeyer lombikokba töltünk. A tenyészeteket 24 napig 25°-on inkubáljuk, majd a micéliumot összegyűjtjük, 40 °C-on szárítjuk, majd megőröljük. A fenti módon nyert, szárított micéliumőrlemény 800 g-ját szobahőmérsékleten 1800 ml acetonban szuszpendáljuk. 1,5 órás lassú keverés után az elegyet 30 percig állni hagyjuk és a felülúszót dekantáljuk. Ezt követően a maradék sűrű diszperz elegyhez 1500 ml aceton és 150 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldatot adunk, további 1,5 órán át keverjük és ismét dekantáljuk. A zagyos alsó részt szűrjük, acetonnal mossuk, szárítjuk. A fenti módon zsír- és alkaloidmentesített anyagot 700 ml 5%-os perklórsav oldattal Waring blendorban 1 percig pépesítjük. A pépes elegyet 1 órán át 0 °C-on állni hagyjuk, majd hűthető centrifugában 0 °C-on centrifugáljuk. A szilárd részt 500 ml 5%-os perklórsawal újra pépesítjük és a fent leírt módon centrifugáljuk. A két centrifugálás során kapott felülúszót egyesítjük (1050 ml). Az egyesített perklórsavas felülúszóhoz annyi triklórecetsavat adunk, hogy az oldat triklórecetsavra számítva 22,5%-os legyen. Az elegyet 12 órán át +4 °C-os hűtőszekrényben állni hagyjuk. A tiszta felülúszót dekantáljuk és a maradék csapadékot centrifugáljuk, majd acetonnal és alkohollal mossuk és szárítjuk. 1,7 g nyers terméket kapunk. Fehérjetartalom (Lowry módszerrel): 35%. 0,5 g nyersterméket 5 ml fiziológiás nátrium-klorid oldatban oldunk, az oldhatatlan maradékot szűréssel eltávolítjuk és a tiszta oldat fehérjeösszetevőit gélkromatográfiával szétválasztjuk. A gélkromatográfiához 3 cm átmérőjű, 80 cm töltetmagasságú, fiziológiás nátriumklorid-oldattal duzzasztott dextrángél [Sephadex G 50 (fine)] oszlopot használunk. Erre az oszlopra visszük fel a szűrt fehérje oldatot, majd azt 40 ml/óra sebességgel, fiziológiás nátrium-klorid oldattal eluáljuk. 5—5 mles eluátumokat szedünk és Lowry-féle fehérje meghatározási módszerrel mérjük azok fehérjetartalmát. Az elválasztás eredményét az 1. ábrán láthatjuk. E szerint 9 egymástól elkülönülő zónában sikerült a nyers fehérjét szétválasztani. A 9 zónához tartozó eluátumokat egyesítjük, és ezekből a fehérje frakciókat 1: 12 arányú acetonnal csapjuk ki, majd azokat elkülönítjük, szárítjuk. Az egyes klavicepamin frakciókat az alábbiak szerint vizsgáljuk. Poliakrilamid-gél elektroforetikus mozgékonyságukat összehasonlítottuk más ismert bázikus fehérjékkel. [Akrilamid koncentráció: 15%; puífer: 150 g karbamid, 53,2 ml 96%-os ecetsav 1000 ml ionszegény vízben oldva (pH = 2,7); alkalmazott feszültség: 130 V; elektroforézis idő: 2 óra; festőoldat: 7 ml jégecet, 20 ml etanol és 100 ml desztillált víz elegyében feloldott 1 g amidofekete; mosófolyadék: 7% ecetsav.] Az eredményt az 1. táblázatban foglaljuk össze. A klavicepamin frakciók aminosav tartalmának meghatározásához 5—5 mg-ot 0,5 ml 6 n sósavban (N-atmoszférában, ampullában) 24 órán át 110 C°-on hidrolizálunk, majd a mintákból JEOL típusú automatikus aminosav analizátorral mennyiségi aminosav meghatározást végzünk (2. táblázat). A gélrétegkromatográfiás molekulasúly-meghatározásnál 0,5 mm vastag Sephadex G75 (superfine) rétegen ismert fehérjékkel együtt végezzük a futtatást, majd az elmozdulások és az ismert molekulasúlyú fehérjékkel készített kalibrációs görbe (2. ábra) alapján számoljuk a klavicepamin frakciók molekulasúlyát (3. táblázat). 2. példa Az OKI nemzeti törzsgyűjteményében 56/1970. szám alatt letétbe helyezett Claviceps purpurea törzs vegetatív tenyészetét sterilezett táptalajra oltjuk, melynek összetétele az alábbi : 100 g szacharóz 10 g borostyánkősav 1 g kalcium(II)-nitrát 1 g élesztőkivonat (Difco) 0,25 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,25 g magnézium-szulfát ad 1000 ml desztillált víz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
