172238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavicepaminok előállítására
7 172238 8 A táptalaj pH értékét sterilezés előtt tömény ammóniumhidroxid oldattal 5,6-ra állítjuk, majd 400—400ml-t 1 literes Erlenmeyer lombikokba töltünk. A tenyészetet 9 napig 25 C°-on Erlenmeyer lombikban rázatjuk, majd szűrjük. A szűrlethez háromszoros térfogatú acetont adunk, a kivált csapadékot eltávolítjuk, majd a szűrlethez 12-szeres mennyiség eléréséig további acetont adagolunk. A csapadékot szűrjük és szárítjuk. A nyersterméket 5 ml desztillált vízben oldjuk, az oldhatatlan maradékot szűréssel eltávolítjuk és a tiszta oldathoz 1: 1 térfogatarányban frissen készült 2%-os vizes Reinecke só oldatot adagolunk. 12 órán át jégszekrényben ( +4 °C) állni hagyjuk, és a kivált terméket + 4 C°-on centrifugáljuk, acetonnal ismételten mossuk, majd szárítjuk. Az így nyert termék fehérjetartalma Lowry szerint 75%, az aminosavtartalmon belül a lizintartalom 63,2 mól%, a guanidin-metilezett arginin tartalom 0,75 mól%. A termék 1 g-ját 10 ml desztillált vízben oldjuk, Seitz EK lapon szűrjük és liofilizáljuk. A termék hatását Nk/Ly és Ehrlich ascites tumor növekedésére az alábbi kísérlettel mutatjuk be: A kísérlethez 60 db, átlagosan 25 g testsúlyú Swiss fehér egeret használunk fel. 30 db állatot hét napos NKLy ascites tumorral (sejtszám 5 X 106), a másik 30-at hét napos Ehrlich ascites tumorral oltjuk be (sejtszám • 5 X106) intraperitonealisan. Az Nk/Ly és Ehrlich ascites tumorral oltott egerek közül egyaránt 15—15 állatot kezelünk, a másik 15—15 állat képezi a kontroll csoportot. A transzplantációt követő napon kezdjük a kezelést, Tween 80-nal fiziológiás nátrium-kloridban szuszpendált 100 mg/testsúlykg anyaggal. A kezelést 7, egymást követő napon át folytatjuk. A transzplantációt követő 10. napon az állatokat leöljük, és megmérjük a hasüregben talált ascites-folyadék mennyiségét, illetve az összsejtszámot. Eredmények : Nk/Ly ascites Ehrlich ascites kezelt kontroll kezelt kontroll Folyadék 0 ml 6,3 ml 0 ml 5,3 ml Sejtszám 0 ml 9,6 X 107/ml 0 ml l^X^/ml Sejt/állat 0 ml 6,1 X108 0 ml 8,5 X 108 3. példa Az OKI nemzeti törzsgyűjteményében 68/1971. szám alatt letétbe helyezett Claviceps fusiformis törzs vegetatív tenyészetét sterilezett táptalajra oltjuk, melynek összetétele az alábbi : 50 g szacharóz 50 g mannit 5 g citromsav 5 g borostyánkősav 1 g ammónium-nitrát 0,25 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,25 g magnézium-szulfát 0,125 g kálium-klorid 0,009 g vas(Jl)-szulfát 0,003 g cink-szulfát ad 1000 ml desztillált víz. A táptalaj pH-értékét sterilezés előtt tömény ammóniumhidroxid oldattal 5,6-ra állítjuk, 100 ml-enként 0,51-es Erlenmeyer lombikokba osztjuk. A tenyésztést 14 napig 25 °C-on rázóasztalon végezzük, ezután a tenyészeteket szűrjük. A micéliummentes szűrlet 7500 ml-éhez 1: 1,5 térfogatarányban 96%-os etanolt adagolunk, a kiváló csapadékot elválasztjuk, etanollal ismételten mossuk, majd vákuumban szárítjuk. 5 g enyhén lilásbarna csapadékot kapunk. A kapott nyersterméket 30 ml desztillált vízben oldjuk, majd a nem oldódó részt hűthető centrifugában szeparáljuk. A felülúszót 1 n sósavval 3-as pH értékre állítjuk, majd az oldathoz 1: 1 térfogatarányban 2%-os vizesReinecke-só oldatot adunk. Az oldatot 12 órán át jégszekrényben ( + 4 °C) tartjuk. A kivált terméket hűthető centrifugában szeparáljuk, és az acetonnal oldható részt 50 ml acetonnal kioldjuk, elválasztjuk, kétszer 25—25 ml acetonnal mossuk, szárítjuk. Kitermelés: 0,6 g klavicepamin. Fehérjetartalom (Lowry módszerrel): 77%. Lizintartalom (az összaminosavtartalomra számítva): 55,6 mól%. E termékkel végzett biológiai vizsgálat eredményét az alábbiakban ismertetett módszerrel mutatjuk be : aj Intraperitonealis (intratumoralis) kezelés hatása Ehrlich ascites tumor növekedésére. Átlagosan 25 g testsúlyú Swiss fehér egerekbe transzplantálunk 7 napos Ehrlich ascites tumort. Sejtszám: 5 X 106 sejt/állat. Az állatokat két csoportra (10—10 állat) osztjuk. Az I. csoportban a transzplantációt követő naptól kezdve 9 napon keresztül kezeljük az állatokat intraperitonealisan 100 mg/testsúlykg termékkel, amelyet előzőleg fiziológiás nátrium-klorid oldatban Tween 80-nal szuszpendálunk és 0,1 n nátrium-hidroxiddal pH 7-re állítunk be. A II. csoportban levő állatok szolgálnak kontrollként. A transzplantációt követő 10. napon az állatokat leöljük, mérjük a hasüregben levő ascites mennyiségét, és meghatározzuk a sejtszámot. Eredmények : Kezelt Kontroll Ascites mennyisége 1,2 ml 6,5 ml Sejtszám (sejt/állat) 6,6 X107 6,8 X108 (Az eredmények csoportonként a 10 állat alapján számított átlag értékek.) b) Subcutan kezelés hatása Ehrlich ascites tumor növekedésére. Az a) pont szerinti kísérletet megismételjük 10—10 Ehrlich ascites tumorral oltott egéren olyan formában, hogy a naponkénti kezelés az állatok hátának bőre alá, subcutan történik, a transzplantációt követő naptól kezdődően 6 napon keresztül. Eredmények : Kezelt Kontroll Ascites mennyisége 2,2 ml 3,2 ml Sejtszám (sejt/állat) 2,0 X108 4,0 X108 c) Intraperitonealis kezelés hatása subcutan oltott Yoshida patkány sarcoma növekedésére. A kísérlethez átlagosan 250 g testsúlyú CF Y patkányokat használunk. Az állatokat néhány db 2—3 mm3-es solid Yoshida tumorral oltjuk be trocar segítségével a hát bőre alatt. Az állatokat két csoportra osztjuk. Az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
