172223. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy diszulfidhídon kívól legalább egy ciszteingyököt tartalmazó peptidek előállítására

13

172223

14

II =Boc-Ala-Cys-OMe

i

Boc-Ala-Cys-OMe.

A csapadékot centrifugálással elkülönítjük, vízzel mossuk és vastagréteg-szilikagél-lapokon (85: 15 ará- 5

nyú) kloroform—metanol-rendszerben kromatografáljuk. A 0,55 R,- értékű címszerinti terméket az említett rendszerben elkülönítjük. Az I szimmetrikus peptid Rf értéke =0,41, a II szimmetrikus peptid Rf értéke = =0,64.

3. példa

Az emberi inzulin szintézise

H-Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-IIe-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu--Asn-Tyr-Cys-Asn-OH

12 3 4

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 ' 20 21

(A lánc)

H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

(B lánc)

A fenti terméket az 1. példában kapott A-lánc 6—13

!------aminosavainak a fregmentje, mégpedig a H-Cys-Cys---------------------------------------i

(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-IIe-Cys-Ser(But)-Leu-OH (I) és a következő további töredékek segítségével állítjuk elő:

II =Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-NH-NH2 (A- lánc 1—5)

III = Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys( Acm)-Gly-Ser

(But)-His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-OH (B-lánc 1—16)

IV =Bpoc-Tyr(But)-Gln-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr(But)--Cys-Asn-OBut H-Leu-Val-Cys-Gly-Glu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)

Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut (A-lánc 14—21 +B-lánc 17—30)

A IV jelű fregmentet a 169 501 számú magyar szabadalmi leírásban és a 2 346 147 számú NSZK-beli nyilvánosságrahozatali iratban írtuk le.

A II jelű fragmentet a következő módon állítjuk elő:

1. Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-OCH3

8,80 g Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-NH-NH2 [Zahn és munkatársai; Z. Naturf. 21b, 763 (1966)] 60 ml abszolút DMF-fel készített szuszpenziójához — 35°-on hozzáadunk 15 ml 3 n dioxános sósavat és 2,24 ml terc-butilnitrilt. A szuszpenziót 15 percig — 20°-on keverjük és az átlátszó oldathoz egymásután hozzáadunk 2.95 g H-Gln-OCHj. HCl-t és 10 ml N-metilmorfolint. A reakcióelegyet ezután 28 óra hosszat jeges fürdőben keverjük, majd a terméket 450 ml hideg vízzel kicsapjuk, a csapadékot mossuk és szárítjuk. A kapott anyagot többször eldörzsöljük (1: 20 arányú) metanol—ecetsavetilészter elegyben, ily módon 8,60 g színtelen port kapunk.

Op. 223—226° (bomlik).

I*1“ = -13° ± 1° (c = 1, DMF-ben).

Vékonyrétegkromatogramban szilikagélen Rrs2 = =0,70,

(7: 2: 1 arányú) kloroform—metanol—trifluoretanol rendszerben Rr =0,65;

(65: 5: 20 arányú) metiletilketon—piridin—víz rendszerben Rf =0,65.

Arg-G ly-Phe-T y r-Thr-Pro-Lys-Thr-OH 22 23 24 25 26 27 28 29 30

2. Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-NH-NH2

7,15 g Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-GIn-OCH3-t feloldunk 100 ml (1: 7 arányú) metanol—DMF elegyben és az oldathoz 10 ml hidrazinhidrátot adunk. Az elegyet 22 óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk és utána a kialakult szilárd masszát 70 ml metanollal hígítjuk, jeges fürdőben keverjük és szűrjük. A csapadékot metanollal eldörzsöljük. Ily módon 6,2 g színtelen port kapunk, amely bomlás közben 243—270°-on olvad.

Md = —37° -r 1° (c =0,75, trifluoretanolban).

Vékonyrétegkromatogramban szilikagélen Rf52 = =0,40;

(7 : 2: 1 arányú) kloroform—metanol—trifluoretanol rendszerben Rf =0,23;

65 : 5 : 20 arányú metiletilketon—piridin—viz rendszerben Rf =0,57.

Az I és II töredékek V töredékké (A-lánc 1—13) kondenzálhatok a következő módon :

!------------------3. Boc-Gly-lle-Val-Glu(OBut)-Gln-Cys-Cys(Acm)^Thr(But)

Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OH (V)

3,33 g Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-NH-NH2-höz 40 ml DMF-ben — 15°-on hozzáadunk 5,59 ml 2,5 n etilacetátos klórhidrogént és 0,7 ml terc-butilnitritet. Ezen a hőmérsékleten 10 perc múlva az elegyhez hozzácsepegtetjük 2,48 g

!----------------------------------------------1

H-Cys-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OH és 2,64 ml N-etilmorfolin 12 ml DMF-fel készített oldatát. Az elegyet 1 óra hosszat — 10°-on és 15 óra hosszat 0°-on állni hagyjuk, utána kis térfogatra betöményítjük és éterrel kicsapjuk a terméket. E terméket ellenáramú megosztással tisztítjuk. A rendszer: metanol—0,075 mólos ammóniumacetát (pH 4,75)—kloroform—széntetraklorid (10:3:8:4). Az anyag 740 eljárási lépés után az 50—83. csövekben van. K. =0,1.

Vékonyrétegkromatogram szilikagélen Rf3 =0,35, Rf52 =0,70.

AIII töredéket a következő módon állíthatjuk elő:

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7