172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére

11

172216

12

Különösen célszerű módszer klavulánsav vagy valamelyik sója elkülönítésére a korábbiakban már említett valamelyik X általános képletű észter hidrogénezése. E hidrogénezést rendszerint valamilyen átmeneti fém katalizátor jelenlétében kis vagy közepes nyomású hidrogéngázzal foganatosíthatjuk. A hidrogénezést végezhetjük csökkentett hőmérsékleten, szobahőmérsékleten vagy megemelt hőmérsékleten, például 0 °C és 100 °C közötti hőmérsékleten. Különösen célszerűen a hidrogénezéshez a légköri nyomásnál valamivel nagyobb nyomást alkalmazunk és közel szobahőmérsékleten (12— 20 C) dolgozunk. A reagál tatást szokásos szerves oldószerekben, így rövidszénláncú alkanolokban, például etanolban végezzük. E célra különösen célszerűen alkalmazható katalizátornak találtuk a szénhordozóra felvitt palládiumot.

Ha a hidrogénezést valamilyen bázis jelenlétében végezzük, valamelyik klavulánsavsó képződik; így például a nátrium- vagy a káliumsót kapjuk, ha a hidrogénezési reakcióelegy nátrium- vagy kálium-hidrogén-karbonátot tartalmaz.

A fentiekben ismertetett módon kapott klavulánsav vagy klavulánsavsó általában megfelelő tisztaságú.

A leírásban az antibiotikumokra korábban említett és a következőkben használt triviális nevek szabatos kémiai megnevezése az alábbi :

karbenicillin = 6-(a-karboxi-a-fenil-acetamido)-2,2-dimetil-penám-4-karbonsav

meticillin = 6-(2,6-dimetoxi-fenil-karbonil-amino)-2,2-dimetil-penám-4-karbonsav 6-APA =6-amino-2,2-dimetil-penám-4-karbonsav

propicillin = 6-(a-etil-a-fenoxi-acetamido)-2,2-dimetil-penám-4-karbonsav

ampicillin = 6-(a-amino-a-fenil-acetamido(2,2-dimetiI-penám-4-karbonsav

amoxicillin = 6-[a-amino-a-(4-hidroxi-fenil)-acetamido]-2,2-dimetil-penám-4-karbonsav

epicillin — 6-[a-am i no-a-) 1,4-cik lohexadién -1 -il>-acetamido]-2,2-dimetil-penám-4-karbonsav

tikarcillin - 6-[a-karboxi-a-(3-tienil)-acetamidoj-2,2-dimetil-penám-4-karbonsav ciklacillin — 6-(l-amino-ciklohexánkarboxamido)-2,2-dimetil-penám-4-karbonsav hetacillin =6-(2,2-dimetil-5-oxo-4-fenil-l-imidazolinil)-2,2-dimetil-penám-4-karbonsav benzilpenicillin - 6-(a-fenil-acetamido)-2,2-dimetil-pecefaloridin

7-ACA

7-ADCA

cefalotin

cefazolin

cefalexin

cefoxitin

nám-4-karbonsav

=7-[a-(2-tienil)-acetamido]-3-( 1 -piridil-metil)-cef-3-em-4-karbonsav = 7-amino-3-acetoximetil-cef-3-em-4- -karbonsav

= 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav =7-{a-(2-tienil)-acetamido]-3-acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsav —7-[a-( 1 -tetrazolil)-acetamido]-3-(5- -»netil-tiadiazol-2-il-tio)-cef-3-em-4- -karbonsav

=7-(a-amino-a-fenil-acetamido)-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav

=*,7-[«-(2-tienil-acetamido]-5-metoxi-3T

-karbamoilmetil-cef-3-em-4-karbonsav

cefacetril

— 7-(a-ciano-acetamido)-3-acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsa v

cefamandol

— 7-[a-(hidroxi-feniI)-acetamido]-3-(l-metil-tetrazol-2-il-tiometil)-cef-3-em-5-4-karbonsav

cefapirin

—7-[a-(4-piridiltio)-acetamido]-3-acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsav

cefradin

—7-[a-amino-a-(l ,4-ciklohexadién-1 -il)-acetamido]-3-metil-cef-3-em-4-kar-10

bonsav

cefaloglicin

=7-(a-amino-«-fenil-acetamido)-3-acet-oximetil-cef-3-em-4-karbonsav A találmányt közelebbről az alábbi kimutatási módszerekkel és kiviteli példákkal kívánjuk megvilágítani.

1. kimutatási módszer

Klavulánsav kimutatására alkalmas kísérleti módszer

20

A kimutatás elvi alapja

0,05 mólos és 7-es pH-jű foszfátpufferben 37 °C-on klavulánsavat tartalmazó oldatokat (például tenyészetet 25 és izolálás utáni mintákat) inkubálunk 15 percen át egy (i-laktamázt tartalmazó készítménnyel. Ezen idő alatt az enzim inhibitálása vagy inaktiválódása következik be. A kísérleti folyadékhoz ezután szubsztrátumot (benzilpenicillint) adunk, majd az inkubálást 30 percen át 30 ugyancsak 37 °C-on folytatjuk. A szubsztrátumnak penicilloilsavvá történő enzimatikus lebomlásának mértékét a penicillinek kimutatására alkalmas hidroxilamin vizsgálattal állapítjuk meg. Az alkalmazott fi-laktamáz mennyiségét úgy állítjuk be, hogy a benzilpenicillin 35 75%-a hidrolizálódjék 30 percen belül az inkubálás hőmérsékletén, vagyis 37 °C-on.

A hidrolízis mértéke tehát a nem inhibitált enzim mennyiségétől függ. Az eredményeket az enzimaktivitás százalékos inhibitálásában, éspedig a klavulánsavat tar- 40 talmazó oldat (azaz például a tenyészet) adott hígításában, vagy pedig a fenti körülmények között az enzim 50%-os inhibitálását okozó klavulánsav [ig/ml-ben kifejezett koncentrációjában (I50) adjuk meg.

.45

fi-laktamáz enzim

A vizsgálatban enzimként az Escherichia coli JT4 által termelt [i-laktamázt használjuk. Ez az említett törzs 50 ampicilünnel szemben rezisztens és megtartja ellenállóképességét egy, az R faktor által kontrollált fi-laktamáz előállításához. Más hasonló, R faktor által kontrollált fi-laktamázok is alkalmazhatók kívánt esetben.

Az agar-agar alapú ferde tenyészeten tartott törzzsel 55 beoltunk 400 ml steril Tripton-táptalajt egy 2 literes Erlenmeyer lombikban. A Tripton-táptalaj összetétele az alábbi: Tripton (gyártja az Oxoid cég) 32 g/1, élesztőkivonat (gyártja az Oxoid cég) 20 g/1, nátrium-klorid 5 g/1 és kalcium-klorid-hexahidrát 2,2 g/1. A táptalaj 60 végső. pH-értékét 7,4-re beállítjuk híg nátrium-hidroxid-oldattal. A lombikot ezután,25 °C:on 20 órán át »ázatjuk 240 fordulat/perc sebességgel működő, forgó mozgást végző rázógépen.

A sejteket ezután centrifugé lássál összegyűjtjük, majd 65 (M)5 mólos és 7-es, pH-értékű foszfátpufierrel moásuk

6