172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére
13 172216 14 (üjraszuszpendáljuk és centrifugáljuk) és ezután vízben újraszuszpendáljuk úgy, hogy a kapott vizes szuszpenzió sejtkoncentrációja 25-szöröse a tenyészetének. Ezt a sejtszuszpenziót azután 4 °C-on MSE típusú ultrahangos dezintegrátorban (gyártja az MSE Scientific Instruments Ltd, Crawley, Sussex, Nagy-Britannia) elroncsoljuk, majd a sejtroncsokat centrifugálás útján elkülönítjük és a felülúszó fázis aliquotjait fagyasztva szárítás után tároljuk. A meghatározáshoz a felülúszó fázist olyan mennyiségű 0,005 mólos foszfátpufferrel hígítjuk, hogy 1 mg/ml koncentrációjú benzilpenicillin-oldatban 30 percen belül 37 °C hőmérsékleten közel 75%-os hidrolízis következzék be. A kimutatási módszer Az inhibitor-készítmény és a ß-laktamäzt tartalmazó oldat alkalmas hígításait összekeverjük, majd 15 percen át 37 °C-on inkubáljuk. Inkubálunk továbbá az inhibitor-készítmény helyett csak puffert tartalmazó kontrolioldatot is. Ezután a kísérleti és a kontrolloldatokhoz szubsztrátumként benzilpenicillin-oldatot adunk, majd az inkubálást 30 percen át 37 °C-on folytatjuk. Minden egyes oldatban a visszamaradó benzilpenicillint ezt követően meghatározzuk az úgynevezett hidroxilamin módszerrel, amelyet Batchelor és munkatársai dolgoztak ki [Proc. Roy. Soc., B 154, 498 (1961)]. Mindegyik kísérleti oldathoz, kontrolloldathoz és vakmintához 6 ml hidroxilamin reagenst adunk, majd a kapott keverékeket szobahőmérsékleten 10 percen át állni hagyjuk és ezután 2—2 ml vas(III)-ammónium-szulfát-reagenst adunk hozzájuk. A végső oldatok abszorpcióját E. E. L. típusú koloriméterrel (gyártja az Evans Elektroselenium Ltd., Harlow, Essex, Nagy-Britannia) vagy spektrofotométerrel 490 nm-nél a reagens-vakmintával szemben meghatározzuk. A hidroxilamin módszer foganatosítása esetén a különböző oldatok összetétele az alábbi: Komponensek (mind feloldva vagy hígítva 0,005 mólos és 7-es pH-jú foszfátpufferrel) Kísérleti oldat ml Benzilpenicillin vakminta ml Kontroll ml Reagens vakminta ml Escherichia coli JT4 által termelt {3-laktamázt tartalmazó oldat 1,9 0,0 1,9 1,9 Inhibitor-oldat 0,1 0,0 0.0 0,0 Benzilpenicillin 5 mg/ml 0,5 0,5 0.5 0,0 0,005 mólos és 7-es pH-jú foszfátpuffer 0,0 2,0 0.1 0,6 Az eredmények számítása A {i-laktamáz százalékos inhibitálását az alábbiak szerint számítjuk ki: A benzilpenicillin vakminta abszorpciója mínusz a kontroll abszorpciója (nem inhibitált reakció)=x A kísérleti oldat abszorpciója (inhibitált reakció) mínusz a kontroll abszorpciója (nem inhibitált reakció)=“=y y Százalékos inhibitálás*=- • 100 X Az I50 érték meghatározására az inhibitor-készítményt addig hígítjuk, míg a fi-laktamáz aktivitásának 50%-os inhibitálása következik be. 2. kimutatási módszer Klavulánsav papírkromatográfiás kimutatása Klavulánsavat tartalmazó szűrt tenyészetből és klavulánsavat tartalmazó referenciaoldatból [250 jzg/ml koncentrációjú, részlegesen tisztított készítmény] 20—20 jxl-t viszünk fel 1 cm széles, Whatman No. 1 jelzésű papírból kivágott csíkokra. Leszálló kromatográfia szerint dolgozva a kromatogramokat 16 órán 5 °C-on futtatjuk futtatószerként n-butanol, izopropanol és víz 7:7:6 arányú elegyét használva. A csíkokat ezután 40 °C-on szárítjuk, majd 6 ;j.g/ml koncentrációban benzilpenicillint tartalmazó és egy, a Klebsiella aerogenes specieshez tartozó, fi-laktamázt termelő törzzsel, éspedig Klebsiella aerogenes NCTC 418 törzzsel beoltott agar-agar lemezekre fektetjük. A lemezeket ezután egy éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk, amikoris a klavulánsav gátolt növekedési zónaként jelentkezik. A zóna Rf értéke 0,46. A 6 [Ag/ml koncentrációban jelenlevő benzilpenicillin önmagában nem képes a mikroorganizmust elpusztítani, azonban egy (i-laktamáz-inhibitor jelenlétében ez a koncentráció toxikussá válik, vagyis szinergizmus jelensége észlelhető. A fenti szinergista rendszer alkalmazása lehetővé teszi a klavulánsav kimutatását már olyan koncentrációkban is, amikor még önmagában nem mutat baktériumelleni hatást. 3. kimutatási módszer Klavulánsav-nátriumsó vékonyrétegkromatográfiás kimutatása Klavulánsav-nátriumsót tartalmazó készítmények oldataiból [koncentráció : 1 mg/ml] 5—5 [tl-t cseppentünk 0,25 mm-es szilikagélréteggel (F254) bevont üveglapokra (a bevonatos üveglapokat az E. Merck darmstadt-i, német szövetségi köztársaságbeli cég szállítja). A kromatogramokat 22 °C-on futtatjuk futtatószerként n-butanol, etanol és víz 4: 1: 5 arányú elegyéből a felső fázist használva. Az üveglapokat ezután 40 °C-on szárítjuk, majd a klavulánsav-nátriumsót úgy jelenítjük meg, hogy az üveglapokat olyan agar-agar lemezekre fektetjük, amelyek 6 [xg/ml koncentrációban benzilpenicillint tartalmaznak és Klebsiella aerogenes mikroorganizmussal vannak beoltva (ennek a szinergista rendszernek a leírását lásd az előző kimutatási módszernél). Az agar-agar lemezek felületét finom szűrőszövettel borítjuk be, mielőtt az üveglapokat rájuk helyeznénk. 15—30 percen át a nedvesedést és diffúziót megengedjük a lapok között, majd az üveglapokat a szűrőszövet segítségével az agar-agar lemezekrőHeemeljük. Az agar-agar lemezeket ezután egy éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk a gátolt növekedésű zónák megjelenítésére. A fenti futtatószerben a klavulánsav-nátriumsó Rf értéke megközelítőleg 0,37. A klavulánsav-nátriumsó zóna előhívására két reagenst, éspedig az úgynevezett Ehrlich-reagenst és a trifenil-tetrazólium-kloridot is használjuk. Az Ehrlich-ieagens 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
