172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére
9 172216 10 szárítjuk, amikoris a klavulánsav nyers szilárd nátriumsóját kapjuk. Az említett Amberlite IR4B enyhén bázikus anioncserélőgyanta poliamin aktív csoportokkal és térhálósított polisztirol-divinilbenzol-mátrixszal, míg a Zerolite FF1P erősen bázikus anioncserélőgyanta reakcióképes kvaterner ammóniumcsoportokkal és térhálósított polivinil-divinilbenzol-mátrixszal. A Zerolite FFIP-hez hasonló gyantaként megemlíthetjük az Isopor FFIP és DeAcidite FFIP SRA—64 gyantákat. Mindezeket a gyantákat a BDH Chemicals LTD. (Dorset, Nagy-Britannia) hozza forgalomba. A fentiekben részletezett izolálási módszerrel kapott nyers csapadék továbbtisztítását különböző ismert módszerekkel végezhetjük, de leginkább célszerűen ioncserélőgyantán végzett kromatografálást alkalmazunk, éspedig ioncserélőgyantaként Isopor, DeAcidite FFIP SRA—64 vagy dietilaminoctil-cellulóz gyantákat alkalmazva. A DeAcidite gyantából készült oszlopot valamilyen só, például nátrium-klorid (0—0,5 mólos) vizes oldatával gradiens-eluálásnak vetjük alá. A dietilaminoetil-cellulóz 0,01 mólos és 7 pH-értékű foszfátpufferrel készült oszlopát valamilyen sóoldattal, rendszerint nátrium-klorid-oldattal (0,01 mólos és 7 pH-értékű foszfátpufferrel készült, 0—0,2 mólos nátrium-klorid-oldat) eluálhatjuk. Az aktív frakciók kimutatását (í-laktamázt inhibitáló aktivitásuk és agar-agar diffúziós vizsgálatban a Klebsiella aerogenes elleni antibakteriális aktivitásuk alapján végezhetjük. Az aktív frakciók zömét összeöntjük, majd vákuumban kis térfogatra bepároljuk. A klavulánsavsónak ezt a tömény oldatát azután Bio Gel P2 márkanevű gyantából készült oszlopon történő átbocsátással sómentesítjük. (A Bio Gel P2 olyan nagymértékben lipofil gyantára példa, amelyen szerves anyagok adszorbeálhatók, ugyanakkor a gyanta nem tartja vissza a szervetlen sókat. A Bio Gel P2 kémiailag nézve poliakrilamid gél, gyártja a Bio Rád richmond-i, amerikai egyesült államokbeli cég). A sómentesített anyagot ezután betöményítjük, etanollal elegyítjük és cellulózból készült oszlopon újra kromatografáljuk eluálószerként butanol, etanol és víz 4: 1: 5 arányú elegyét használva. Ezután azokat a frakciókat, amelyek az Escherichia coli törzsbe tartozó mikroorganizmusok által termelt fi-laktamáz hatását gátolják, összeöntjük, majd vákuumban szárazra pároljuk, vízben újrafeloldjuk és fagyasztva szárítjuk, amikoris a klavulánsav-nátriumsót kapjuk fehér csapadék formájában. A klavulánsavnak a tenyészetben kimutatására legcélszerűbb módszer a papírkromatográfia és egy bioautográfiás detektálási módszer. A klavulánsav [í-laktamázt inhibitáló hatása alapján mutatható ki. Szilárd készítményekben a klavulánsav kimutatására vékonyrétegkromatográfiát alkalmazhatunk. Ezeket a kimutatási és meghatározási módszereket a későbbiekben még részletesen ismertetjük. A klavulánsav és sói tisztítására alternatív módon eljárhatunk úgy is, hogy a nyers klavulánsavat vagy klavulánsavsót elkülönítjük, majd ismert módon klavulánsavésztert képzünk, és az észterből ezt követően a klavulánsavat vagy sóját felszabadítjuk. A nyers klavulánsav vagy sója rendszerint legalább 1 *úly% hatóanyagot tartalmaz. Az észteren át történő tisztításhoz célszerűen alkainwzható észterek közé olyan észterek tartoznak, ame^szteresoportja hidrogenollzis útján, enzimes módszerek segítségével vagy pedig igen enyhe körülmények között hidrolízis útján lehasíthatók. Az e célra alkalmas észterek közé tartoznak többek között a X általános képletű észterek, amelyekben A7 jelentése hidrogénatom vagy adott esetben halogénatommal, 1—4 szénatomos alkil- vagy 1—4 szénatomos alkoxicsoporttal helyettesített fenilcsoport, Ag pedig adott esetben halogénatommal, 1—4 szénatomos alkil- vagy 1—4 szénatomos alkoxicsoporttal helyettesített fenilcsoportot jelent. Célszerűen A7 jelentése hidrogénatom vagy fenil-, tolil-, klór-fenil- vagy metoxi-fenilcsoport, A8 jelentése pedig fenil-, tolil-, klór-fenil- vagy metoxi-fenilcsoport. Előnyösen A7 hidrogénatomot, A8 pedig fenilcsoportot jelent. A X általános képletű észterek hidrogenolízissel konvertálhatók klavulánsavvá vagy ennek valamilyen sójává. A nyers klavulánsav vagy sója akár szilárd alakban, akár oldatban, jelentős mennyiségű szerves vagy szervetlen szennyezőanyagot tartalmaz. A nyers klavulánsav vagy sója tisztításához alkalmazott klavulánsavészterek előállításának előnyös módja valamilyen klavulánsavsó és például egy reakcióképes halogenid vagy szulfonátészter reagáltatása. Ezeket az észterezéseket legtöbbször valamilyen, nagy dielektromos állandójú szerves oldószerben, például dimetif-formamidban, dimetil-formamid és aceton elegyében, dimetil-szulfoxidban, N-metil-acetamidban vagy hexametil-foszforsav-triamídban végezhetjük. Kívánt esetben a klavulánsavsó hagyományos módon feloldható az alkalmazott oldószerben vagy pedig valamilyen polimerjellegű hordozóanyaghoz „köthető". Az e célra alkalmazható hordozóanyagokra példaként megemlithetjük az erősen bázikus anioncserélőgyantákat, különösen a makrohálós jellegűeket, amelyek lehetővé teszik nemvizes oldószerrendszerek alkalmazását. Különösen alkalmasnak találtuk erre a célra az Amberlyst A26 márkanevű gyantát. A klavulánsavsó a tenyészetből a gyantára adszorbeálható, majd a gyantát nátrium-jodidot tartalmazó dimetil-formamidban szuszpendáljuk, vagy pedig alternatív módon oszlopot képezve belőle nátrium-jodid dimetil-formamiddal vagy dimetil-formamid és aceton elegyével képzett oldatával eluáljuk. A képződött nyers klavulánsavésztert rendszerint kromatográfiás úton tisztítjuk. Ennek során rendszerint az észtert valamilyen szerves oldószerben, például etil-acetátban, metilén-kloridban, kloroformban vagy ciklohexánban feloldjuk. A kromatografáláshoz használt szilárd fázis rendszerint valamilyen inert anyag, például szilikagél vagy kromatográfiai szempontból a szilikagélhez hasonló anyag. Az oszlopot elhagyó frakciókban a klavulánsav jelenlétét úgy állapítjuk meg, hogy megvizsgáljuk a frakciók szinergista hatását. Az aktív frakciókat rendszerint egyesítjük, majd a szerves oldószert csökkentett nyomáson elpárologtatjuk. Az így tisztított észter általában elfogadható tisztaságú, azonban kívánt esetben újabb kromatografálással továbbtisztítható. Az így tisztított klavulánsavészter továbbá a korábbiakban már ismertetett módon klavulánsavvá vagy valamelyik sójává konvertálható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
