172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére
7 172216 8 Rendszerint a gyógyászati készítményből napi 50— 6000 mg, gyakrabban 500—3000 mg mennyiséget adunk be a kezelendő fertőzés gyógyítására, azonban súlyos szisztemikus fertőzések vagy különösen veszélyes mikroorganizmusok okozta fertőzések kezelésére nagyobb dózisok is alkalmazhatók a klinikai gyakorlattal összhangban. A gyógyászati készítmény konkrét formája bizonyos mértékben függ a fertőzést okozó mikroorganizmus jellegétől is. A legtöbb fertőzés kezelésére a gyógyászati készítmény hatóanyagtartalmát úgy állítjuk be, hogy a vérben a szinergista anyag koncentrációja legalább 0,1 (i.g/ml, célszerűen legalább 0,25 p.g/ml és előnyösen legalább 1,0 [xg/ml, így például 2,5—5 p.g/ml legyen. A találmány szerinti szinergikus hatású gyógyászati készítményekben a penám-karbonsavszármazék vagy cefem-karbonsavszármazék mennyisége rendszerint legfeljebb annyi vagy közel azonos azzal a mennyiséggel, amelyet hagyományosan használnánk abban az esetben, ha a gyógyászati készítmény hatóanyagként kizárólag ezeket a vegyületeket tartalmazná. Különösen előnyösnek tartjuk azokat a készítményeket, amelyek 150—1000 mg mennyiségben amoxicillint, ampicillint vagy ezek valamilyen pro-drugját és 50— 500 mg mennyiségben klavulánsavat vagy ennek valamilyen sóját tartalmazzák, illetve még előnyösebben 200—500 mg amoxicillint, ampicillint vagy ezek valamilyen pro-drugját és 50—250 mg klavulánsavat vagy ennek valamilyen sóját tartalmazzák. A készítményekben levő hatóanyagok adott esetben hidratálva lehetnek. A készítményekben levő antibiotikumok mennyisége a készítményből elméletileg felszabaduló antibiotikum mennyiségének, és nem a prodrug mennyiségének felel meg. Mint említettük, a klavulánsav, valamint sói kinyeréséhez kiindulási anyagként használt fermentlé előállítására a Streptomyces clavuligerus specieshez tartozó törzsek valamelyikét tenyésztjük. A képződött klavulánsavat vagy sóját a tenyészetből a találmány értelmében elkülönítjük, és ezután kívánt esetben sójából a szabad savat felszabadítjuk. Elkülöníthetjük a tenyészetből a klavulánsavat észtere formájában is, majd az észterből a szabad savat vagy valamelyik sóját önmagában ismert módon felszabadíthatjuk. A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként használt fermentlét előnyösen a Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 törzs tenyésztése útján állítjuk elő. A tenyésztés alatt azt értjük, hogy a Streptomyces clavuligerus aerob növekedését elősegítjük asszimilálható szén- és nitrogénforrás, valamint ásványi sók jelenlétében. Az ilyen aerob növekedés végbemehet szilárd vagy félszilárd táptalajban vagy pedig folyékony közegben, amikoris a tápanyagok a folyékony közegben oldva vagy szuszpendálva vannak. A tenyésztést aerob felületen vagy merített kultúrában végezhetjük. A tápanyagok komplex tápanyagok tehernek. Megállapítottuk, hogy a komplex tápanyagok, Így például az élesztőkivonatok és a szójababliszt különösen előnyösek. A Streptomyces clavuligerus tenyésztéséhez használt táptalaj tartalmazhat 0,1—10% mennyiségben valamilyen komplex szerves nitrogénforrást, például élesztőkivonatot, kukoricalekvárt, növényi proteint, magproteint, ilyen proteinek hidrolizátumait, tejprotein hidrolizátumait, hal- és húskivonatokat és ezek hidrolizátumait, például peptonokat. Alternatív módon használhatunk kémiailag egyértelműen meghatározható nitrogénforrást, például karbamidot, amidokat, egyszerű aminosavakat, így például valint, aszpargint, glutaminsavat, prolint vagy fenilalanint vagy ezek keverékeit. A táptalaj tartalmazhat továbbá 0,1—5% mennyiségben szénhidrátokat, azonban bizonyos táptalajok esetében a glükóz használata hátrányos lehet, minthogy csökkenti a klavulánsav hozamát. A táptalaj tartalmazhat továbbá keményítőt vagy keményítőhidrolizátumot, így például dextrint, szacharózt, laktózt vagy más cukrokat vagy glicerint vagy glicerin-észtereket. A szénforrás is származhat növényi olajokból vagy állati zsírokból. Szénforrásként tartalmazhat továbbá a táptalaj karbonsavakat és ezek sóit. Különösen alacsony beszerzési költségű és előnyösen alkalmazható táptalaj a szójabablisztből (Arkasoy), dextrinből és szárított zöldmalátamaradékból (Scotasol) álló táptalaj. Kívánt esetben a tenyészethez habzásgátlót, például a Pluronic L81 jelzésű készítményt adhatjuk a fermentorokban bekövetkező habzás megelőzésére. A fentiekben említett kémiailag egyértelműen meghatározható vegyületekből álló táptalajokhoz ásványi sókat, például nátrium-kloridot, kálium-kloridot, magnézium-kloridot, cink-kloridot, vas(IIl)-kloridot, nátrium-szulfátot, vas(II)-szulfátot, magnézium-szulfátot és a foszforsav mononátrium- és monokáliumsóját is adhatjuk. Kívánt esetben kalciumionforrásként vagy pufferoló hatása végett a táptalajhoz kalcium-karbonátot is adhatunk. Tartalmazhat továbbá a táptalaj kívánt esetben nyomelemsókat, például nikkel-, kobalt- vagy mangánsókat, valamint vitaminokat is. A Streptomyces clavuligerus tenyésztését rendszerint 15 °C és 40 °C, még gyakrabban 20 °C és 35 °C, előnyösen pedig 25 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten, illetve 5 és 8,5, előnyösen 6 és 7,5 közötti pH-értéken végezzük. A Streptomyces clavuligerus tenyésztését végezhetjük forgó rázógépen végzett rázatás útján levegőztetett Erlenmeyer-lombikokban vagy szárnyas keverővei kevert és levegőt diszpergáló egységgel levegőztetett, rozsdamentes acélból készült fermentorokban. Végezhetjük a fermentálást folyamatosan is. A fermentálás kezdeti pH-értékeként rendszerint a 7,0 értéket választjuk. A klavulánsav maximális hozama rendszerint 2—10 napon át 20—35 °C-on végzett tenyésztés után érhető el. Kevert, rozsdamentes acélból készült fermentorban a fentiekben már említett, Arkasoy, Scotasol és dextrin komponenseket tartalmazó táptalajt használva az előnyös tenyésztési hőmérséklet 26 °C és a klavulánsav csúcshozama 5 napon belül jelentkezik. A Streptomyces clavuligerus sejtjeit a találmány szerinti eljárás végrehajtását megelőzően először rendszerint eltávolítjuk a tenyészetből szűrés vagy centrifugálás útján. A találmány szerinti elkülönítési módszer értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a szűrt és közel semleges vagy enyhén savas pH-értékre, például 6 és 7 közé beállított tenyészetet gyenge vagy erősen bázisos anioncserélőgyantából, például Amberlite IR4B (gyenge) vagy Zerolit FFIP gyantából készült oszlopon bocsátjuk át addig, míg a gyanta telítődik és a {i-laktamázt inhibitáló anyag megjelenik az oszlopot elhagyó folyadékban. Az oszlopot ezután vízzel mossuk,, majd vizes nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. A ß-laktamäz hatását inhibitáló frakciókat összeöntjük, sómentesitjük és fagyasztva 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
