172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére
25 172216 26 19. példa Szilárd klavulánsav-nátriumsó izolálása A 17. példában ismertetett módon kapott, részben tisztított anyagból 500 mg-ot felviszünk egy 25 mm x 500 mm méretű, a korábban említett Whatman cég által gyártott Whatman mikrokristályos CC 31 cellulózzal töltött oszlopra, majd az oszlopot 4 °C-on n-butanol, etanol és víz 4:1:5 arányú elegyéből a felső fázissal eluáljuk. 4 ml-es frakciókat gyűjtünk, majd a frakciókat megvizsgáljuk klavulánsavra úgy, hogy a frakciókból 1—1 cseppet cseppentünk szűrőpapírra, majd a kapott foltot Ehrlich-reagenssel (pozitív esetben rózsaszínű folt jelenik meg) vagy trifenil-tetrazólium-klorid reagenssel (pozitív esetben vörös folt jelenik meg) bepermetezzük. Ezeket a foltvizsgálatokat az 1/2500-szoros hígításban elvégzett ß-laktamäz inhibitálási meghatározások igazolják. Az aktív frakciókat ezután összeöntjük, majd forgó bepárlóban vákuumban bepároljuk. A kapott szilárd anyagot kis mennyiségű desztillált vízben feloldjuk, majd a vizes oldatot fagyasztva szárítjuk. így szilárd fehér készítmény formájában 40 mg klavulánsav-nátriumsót kapunk, amelynek I50 értéke 0,08 ug/ml. 20. példa Szilárd klavulánsav-nátriumsó izolálása Kiindulási anyagként a 16. példában végzett ultracentrifugálással koncentrált 6 liternyi vizes extraktumot — amely az 1. kimutatási módszer szerint vizsgálva 10 g klavulánsavat tartalmaz — használunk. Ezt a vizes oldatot 1 liter/óra sebességgel átbocsátjuk 50 mm x 600 mm méretű, klorid-formájú Permutit Zerolit FF 1 P SRA 62 anioncserélőgyantával töltött oszlopon, majd az oszlopot eluálása előtt 2 liter ionmentes vízzel mossuk. Az oszlopot ezután gradienseluálásnak vetjük alá, éspedig a gradienst úgy képezzük, hogy egy, 4 liter 1,4 mólos nátrium-klorid-oldatot tartalmazó tartály egy, 4 liter 0,7 mólos nátrium-klorid-oldatot tartalmazó kevert tartályt táplál, az utóbbi tartály viszont össze van kötve egy, 4 liter ionmentes vizet tartalmazó kevert tartállyal, ami egy szivattyún keresztül kapcsolódik az oszlophoz. Az oszlopot 2,5 ml/perc sebességgel eluáljuk és 25 ml-es frakciókat gyűjtünk. A frakciókat megvizsgáljuk ß-laktamäz inhibitálási aktivitásukra. Az aktív frakciókat (140—230. frakciók) összeöntjük, majd vákuumban csaknem szárazra pároljuk. A maradékhoz ezután 500 ml etanolt adunk és erőteljes rázás után a kivált csapadékot kiszűrjük. Az etanolos extraktumot ezután forgó bepárlóban vákuumban szárazra pároljuk, majd a kapott szilárd anyagot 40 ml ionmentes vízben újraoldjuk. Ezt a vizes oldatot ezután felvisszük egy, 100 mm x 600 mm méretű, Bio Gel P2 gyantával töltött oszlopra, majd az oszlopot 1%-os vizes n-butanol-oldattal eluáljuk. 25 ml-es frakciókat gyűjtünk, majd 1/2500-szoros véghígításban vizsgáljuk a frakciók ß-Iaktamáz inhibitálási aktivitását. Kísérleteket végzünk ugyanakkor a frakciók nátrium-klorid tartalmának meghatározására 1/25-szörös hígításban ezüst-nitrát-oldattal. Azokat a frakciókat, amelyek klavulánsavat tartalmaznak és nátrium-kloridtól mentesek, összeöntjük, majd csökkentett nyomáson az oldószer elpárologtatása útján 20 ml térfogatra betöményítjük. A koncentrátumot ezután fagyasztva szárítjuk. így 4,8 g klavulánsav-nátriumsót kapunk [150 értéke közel 0,06 tag/ml]. 21. példa Klavulánsav-benzilészter előállítása S. clavuligerus tenyésztése útján kapott fermentléből nyert nyers extraktumból A 10. példában ismertetett módon kapott szűrt fermentléből 20 litert kúszófilmes vákuumbepárlót használva 5 liter térfogatra töményítünk, majd a kapott koncentrátumot Edwards E. F. 6 típusú fagyasztva szárító berendezést (gyártja az Edwards High Vacuum Ltd. cég Crawley, Sussex, Nagy-Britannia) használva fagyasztva szárítjuk. Az így kapott 300 g-nyi szilárd anyag 3 g klavulánsav-nátriumsót tartalmaz a ß-laktamäz inhibitálási vizsgálat tanúsága szerint. Az anyagot 900 ml vízmentes dimetil-formamidban szuszpendáljuk, majd a szuszpenzióhoz 150 ml benzil-bromidot adunk. A reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten 2 órán át keverjük, majd 1 liter etil-acetáttal hígítjuk. Ezt követően a reakcióelegyet szűrjük, majd a szűrletet a lehető legkisebb térfogatra betöményítjük. Az olajos maradékot további 1 liter etil-acetáttal extraháljuk, majd az extraktumot szűrjük. A szűrletet ismételten bepároljuk, majd a kapott olajos maradékot ciklohexánnal felvisszük egy, 75 mm x 350 mm méretű, szilikagéllel (a korábban említett BioRad cég által gyártott Biogel Biosil A 100 mesh márkanevű termék) töltött oszlopra. Az oszlopot először ciklohexánnal eluáljuk a benzil-bromid eltávolítására, majd pedig etil-acetáttal eluálunk és 20 ml-es frakciókat gyűjtünk. A frakciókat ezután megvizsgáljuk a kívánt vegyület jelenlétére nézve, éspedig úgy, hogy a frakciókból egy-egy cseppet felviszünk üvegalapú, szilikagéllel (a Merck cég által gyártott ún. előrebevont Silicagel 60 F 254 lemezeket használunk) bevont vékonyrétegkromatográfiás lemezekre, majd a lemezeket 2,3,5-trifenil-tetrazólium-klorid (továbbiakban: TTC) reagenssel bepermetezzük, Az ezzel a reagenssel intenzív vörös foltot adó frakciókat tovább vizsgáljuk vékonyrétegkromatográfiásan szilikagél lemezeken futtatószerként kloroform és etil-acetát 8 : 2 arányú elegyét használva és az előhívást TTC spray segítségével végezve. 22 °C-on a klavulánsav-benzilészter Rf értéke 0,31. Az ezt az észtert tartalmazó frakciókat összeöntjük, majd 15 ml-re betöményítjük és a kapott koncentrátumot egy 37 mm x 400 mm méretű, szilíkagélből (a Merck cég „silica gel H type 60” jelzésű terméke) készült oszlopon eluálószerként kloroform és etil-acetát 8: 2 arányú elegyét használva kromatografáljuk. 15 ml-es frakciókat gyűjtünk, majd az előzőekben ismertetett módon a frakciókat benziiészter-tartalmukra nézve vizsgáljuk. Az észtert tartalmazó frakciókat összeöntjük, majd 8 ml térfogatra bepároljuk és végül egy 25 mm x 400 mm méretű, az előző kromatografálási műveletnél említett típusú szilikagéllel töltött oszlopon eluálószerként etil-acetát és ciklohexán 8: 2 arányú elegyét használva kromatografáljuk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összeöntjük, majd vákuumban bepároljuk, amikoris 160 mgnyi olaj formájában a klavulánsav-benzilésztert kapjuk. E terméket szabad klavulánsav vagy klavulánsavsó előállítására használjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
